Η σχιζοφρένεια και η διπολική διαταραχή είναι από τις πιο σοβαρές ψυχιατρικές διαταραχές. Με έναν συνδυασμένο επιπολασμό κατά τη διάρκεια της ζωής του 1-4% του γενικού πληθυσμού ¹ , αυτές οι διαταραχές αντιπροσωπεύουν το 4-5% του συνόλου της αναπηρίας στον ανεπτυγμένο κόσμο ² και σχετίζονται με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας λόγω αυτοκτονίας, κακής αυτοεξυπηρέτησης και αυξημένης κίνδυνος για καρδιαγγειακά νοσήματα και διαβήτη ³ . Οικογενειακές και δίδυμες μελέτες έχουν αναφέρει σταθερά υψηλή κληρονομικότητα (~0,80) και για τις δύο διαταραχές ⁴ , ωστόσο μόνο ένα μέτριο μέρος της γενετικής διακύμανσης κάθε διαταραχής έχει εξηγηθεί σε μοριακό επίπεδο.

Η ιστορική διάκριση μεταξύ σχιζοφρένειας και διπολικής διαταραχής, η οποία βασίστηκε σε μελέτες κλινικής παρατήρησης στα τέλη του 19ου αιώνα, αμφισβητήθηκε από πρόσφατα γενετικά στοιχεία. Συγκεκριμένα, αρκετά αλληλόμορφα που έχουν προκύψει από μελέτες συσχέτισης σε όλο το γονιδίωμα (GWAS) μιας διαταραχής έχουν δείξει σημαντική συσχέτιση με την άλλη διαταραχή ⁵ . Επιπλέον, ένα υποτιθέμενο σύνολο πολυγονιδιακών παραγόντων κινδύνου που περιλαμβάνει χιλιάδες κοινά αλληλόμορφα μικρής επίδρασης μπορεί ταυτόχρονα να προβλέψει τον κίνδυνο τόσο για σχιζοφρένεια όσο και για διπολική διαταραχή, αλλά όχι για μη ψυχιατρική νόσο (ή ακόμα και για ορισμένες άλλες ψυχιατρικές διαταραχές) ^{6 , 7} . Αυτά τα μοριακά δεδομένα υποστηρίζονται περαιτέρω από επιδημιολογικές μελέτες πληθυσμιακής κλίμακας, οι οποίες έχουν εντοπίσει αυξημένη αδερφική υποτροπή της σχιζοφρένειας μεταξύ συγγενών πρώτου βαθμού διπολικών ασθενών και αντίστροφα ⁸ . Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ο συνδυασμός κοορτών σχιζοφρένειας και διπολικής διαταραχής σε μελέτες μοριακής γενετικής μπορεί να έχει διπλά πλεονεκτήματα στην ενίσχυση της ισχύος αυξάνοντας το κατάλληλο μέγεθος δείγματος και εντοπίζοντας τους πιο θεμελιώδεις παράγοντες κινδύνου στην αιτιολογία της σοβαρής ψυχιατρικής διαταραχής.

Προηγούμενα GWAS τόσο στη σχιζοφρένεια όσο και στη διπολική διαταραχή έδειξαν ότι πολλά κοινά αλληλόμορφα μικρού αποτελέσματος απομένουν να ανιχνευθούν ⁹ , αλλά μπορεί να απαιτούνται πολύ μεγάλες κοόρτες ανακάλυψης (~10.000 άτομα) προκειμένου να εντοπιστούν πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (SNPs) επιτυγχάνοντας σαφείς ενδείξεις σημασία σε όλο το γονιδίωμα ^{10 , 11} . Ωστόσο, έχει προταθεί ότι οι ιδρυτικοί πληθυσμοί μπορεί να διαθέτουν ενισχυμένη ισχύ για την ανίχνευση των επιδράσεων ορισμένων κοινών αλληλόμορφων που επηρεάζουν πολύπλοκες ασθένειες, ως αποτέλεσμα της μειωμένης ετερογένειας αλληλόμορφων και θέσεων ¹² . Επιπλέον, το GWAS που διεξάγεται σε ομοιογενείς πληθυσμούς μπορεί να ελαχιστοποιήσει τα στατιστικά τεχνουργήματα λόγω της διαστρωμάτωσης του πληθυσμού ¹³ . Ταυτόχρονα, τα κοινά αλληλόμορφα αλληλόμορφα κινδύνου που εντοπίστηκαν στις μελέτες GWAS έχουν γενικά αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την ευαισθησία σε ασθένειες σε πολλές εθνότητες ¹⁴ , υποστηρίζοντας τη χρήση κοορτών κοσμοπολίτικης αναπαραγωγής.

Εδώ εκτελούμε ένα GWAS σε μια εθνοτικά ομοιογενή ομάδα περιπτώσεων με σχιζοφρένεια και ελέγχους που προέρχονται από τον εβραϊκό πληθυσμό Ασκενάζι. Αντιγράφουμε το κορυφαίο, σε όλο το γονιδίωμα σημαντικό SNP μας (rs11098403) σε 11 ανεξάρτητες κοόρτες ασθενών-μαρτύρων σοβαρής ψυχιατρικής διαταραχής (που περιλαμβάνουν 5.415 περιπτώσεις σχιζοφρένειας, 4.785 διπολικές περιπτώσεις και 12.991 ελέγχους) που προέρχονται από πολλούς πληθυσμούς. Στη συνέχεια εξετάζουμε τη λειτουργικότητα του rs11098403 δοκιμάζοντας την επίδραση αυτής της παραλλαγής στην έκφραση γονιδίων σε μεταθανάτιο εγκεφαλικό ιστό και πραγματοποιώντας συμπληρωματικά πειράματα in vitro και in silico , εμπλέκοντας έτσι ένα γειτονικό γονίδιο, το NDST3 . Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ανωμαλίες στον μεταβολισμό της θειικής ηπαράνης (HS) στον εγκέφαλο μπορεί να αποτελούν τη βάση τόσο της σχιζοφρένειας όσο και της διπολικής διαταραχής.

Ανάλυση συσχέτισης σε επίπεδο γονιδιώματος

Χρησιμοποιώντας συστοιχίες Illumina HumanOmni1-Quad, προσδιορίσαμε γονότυπο μια εθνοτικά ομοιογενή κοόρτη Εβραίων Ασκενάζι (AJ) ασθενών με σχιζοφρένεια και αντίστοιχους ελέγχους (Μέθοδοι). Μετά τον ποιοτικό έλεγχο, το τελικό σύνολο δεδομένων περιελάμβανε 904 περιπτώσεις και 1.640 μάρτυρες γονότυπους σε 762.372 υψηλής ποιότητας SNP με 99,8% συνολικό ποσοστό κλήσης ( Συμπληρωματικά Σχήματα S1,S2 ). Η λογιστική παλινδρόμηση (προσθετικό μοντέλο) έδωσε ένα μόνο σημαντικό σήμα σε όλο το γονιδίωμα στο χρωμόσωμα 4q26. Αυτή η κορυφή περιελάμβανε τα δεκαέξι πιο έντονα συνδεδεμένα SNP στο γονιδίωμα, όλα με P <10-6 ⁽ Εικ . 1 , Συμπληρωματικά Δεδομένα S1 ). Συνολικά πέντε SNP έπεσαν κάτω από το όριο σημαντικότητας για το γονιδίωμα της μελέτης P <6,56 × 10 ⁻⁸ , με το πιο ισχυρά συσχετισμένο SNP, rs11098403, να λαμβάνει P _gwas =6,55 × 10 ⁻⁹ (αναλογία πιθανοτήτων (OR) για ελάσσονα ( Ζ) αλληλόμορφο=1,41, διάστημα εμπιστοσύνης 95%=1,26–1,59, Ισορροπία Hardy–Weinberg για έλεγχο P =0,23, περίπτωση P =0,76 και συνολική P =0,14). Για αυτήν την ανάλυση, λ _GC =1,038, που θεωρείται «καλοήθης» ¹³ (βλ. διάγραμμα Q–Q στο Σχ. 2 ). Τα αποτελέσματα παρέμειναν επίσης σημαντικά σε όλο το γονιδίωμα ( P =4,52 × 10 ^-8 , λ _GC =1,002) όταν εξετάστηκαν με το EMMAX, το οποίο ελέγχει τις επιπτώσεις της διαστρωμάτωσης του υπολειπόμενου πληθυσμού και της λεπτής κρυπτικής συνάφειας.

Η λογιστική παλινδρόμηση (προσθετικό μοντέλο) χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η συσχέτιση μεταξύ γενετικών παραλλαγών και σχιζοφρένειας στην εβραϊκή κοόρτη ανακάλυψης Ashkenazi.

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Η λογιστική παλινδρόμηση (προσθετικό μοντέλο) χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η συσχέτιση μεταξύ γενετικών παραλλαγών και σχιζοφρένειας στην εβραϊκή κοόρτη ανακάλυψης Ashkenazi.

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Μια λίστα με όλα τα SNP που επιτυγχάνουν ονομαστικές τιμές P <10 ⁻⁴ παρέχεται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα S1 . Συγκεκριμένα, επτά SNP σε αυτόν τον κατάλογο βρίσκονται στο MHC, το οποίο συσχετίζεται σταθερά με την ευαισθησία στη σχιζοφρένεια σε μεγάλης κλίμακας GWAS ^{6 , 10} . Τα συμπληρωματικά δεδομένα S2 εμφανίζουν μια συστηματική αξιολόγηση των επιπτώσεων στην κοόρτη ανακάλυψης για SNP που επιτυγχάνουν σημασία σε επίπεδο γονιδιώματος σε προηγούμενες μεγάλης κλίμακας ( N >10.000 σε κοόρτες ανακάλυψης+αντιγραφής) μελέτες GWAS για σχιζοφρένεια ή διπολική διαταραχή (που λαμβάνεται από τον κατάλογο NHGRI GWAS ( http://www.genome.gov/gwastudies/ , που λήφθηκε στις 10 Ιανουαρίου 2013, για επίσημες δοκιμές, συγκρίναμε την κατεύθυνση των επιδράσεων σε 23 τόπους (εξαιρουμένου του MHC) για τους οποίους ήταν διαθέσιμα τα SNP άμεσα ή μεσολάβησης Ο ανεξάρτητος τόπος αναπαρίσταται μόνο μία φορά σε αυτήν την ανάλυση για να αποφευχθεί ο πλεονασμός λόγω της ανισορροπίας σύνδεσης ( ^LD ) . όλα τα διαθέσιμα SNP που αναφέρθηκαν από την Psychiatric GWAS Consortium mega-analysis of schizophrenia ¹⁰ Επιπλέον, τέσσερις τόποι ήταν ονομαστικά σημαντικοί στο σύνολο δεδομένων μας, συμπεριλαμβανομένων των SNP στο εκτεταμένο MHC καθώς και στα NT5C2, PTGFR και CACNA1C .

Λόγω της έλλειψης πάνελ αναφοράς HapMap ειδικά για τον πληθυσμό των Ασκενάζι, οι πρωτογενείς αναλύσεις διεξήχθησαν μόνο σε γονότυπο SNP. Ωστόσο, ο καταλογισμός σε όλο το γονιδίωμα χρησιμοποιώντας δεδομένα HapMap3 με πιο πυκνό γονότυπο δεν άλλαξε ουσιαστικά τα αποτελέσματα. κανένα τεκμαρτό SNP δεν πέτυχε ισχυρότερες τιμές P συσχέτισης από αυτές που αναφέρθηκαν για το κορυφαίο γονότυπο SNP μας, rs11098403. Τόσο στα δεδομένα γονότυπου όσο και στα τεκμαρτά δεδομένα, ονομαστικά σχετιζόμενα SNPs παρατηρήθηκαν σε ένα διάστημα ~300 kb στο χρωμόσωμα 4 (~118,7-119,0 MB σε συντεταγμένες Build 36/hg18· Εικ. 3 ). Αυτός ο τόπος βρίσκεται μέσα σε μια διαγονιδιακή περιοχή στην περιοχή του NDST3 . το 5′-άκρο αυτού του γονιδίου είναι ~308 kb από το rs11098403. Η ανάλυση υπό όρους δεν αποκάλυψε σημαντικές συσχετίσεις (όλα Ρ > 0,01) εντός μιας περιοχής 1-MB μετά τον έλεγχο των επιδράσεων του rs11098403 ( Συμπληρωματικό Σχήμα S3 ).

Σημειώστε ότι κανένα τεκμαρτό SNP δεν έχει χαμηλότερη τιμή P (βάσει λογιστικής παλινδρόμησης στο μοντέλο πρόσθετου) από το rs11098403.

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Αντιγραφή και μετα-ανάλυση

Το κορυφαίο SNP στην κοόρτη ανακάλυψης των Ασκενάζι, rs11098403, αξιολογήθηκε σε 11 ανεξάρτητες κοόρτες ελέγχου περίπτωσης σχιζοφρένειας ή διπολικής διαταραχής διαφορετικών εθνοτήτων, που περιείχαν επιπλέον 10.200 περιπτώσεις και 12.991 ελέγχους. Επιπλέον, αναζητήσαμε αντιγραφή σε κοσμοπολίτικα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων της αφρικανικής και ασιατικής ηπειρωτικής καταγωγής, προκειμένου να προσδιορίσουμε εάν το σήμα που παρατηρήθηκε στη κοόρτη ανακάλυψης ήταν μοναδικό για τον πληθυσμό των Ασκενάζι ή ήταν απλώς ισχυρότερο στον πληθυσμό των Ασκενάζι, αλλά αναπαραγόταν σε όλους τους πληθυσμούς.

Τα αποτελέσματα του αρχικού GWAS υποστηρίχθηκαν σε αυτές τις ανεξάρτητες κοόρτες ( Πίνακας 1 και Εικ. 4 , σημειώστε ότι οι τιμές P (προσθετικό μοντέλο) είναι διπλής όψης για την κοόρτη ανακάλυψης και για τις συνδυασμένες αναλύσεις, ενώ οι τιμές P 1 όψης είναι παρατίθενται για τις κοόρτες αναπαραγωγής). Η μετα-ανάλυση για το rs11098403 σε όλες τις κοόρτες (χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σταθμισμένης βαθμολογίας Z όπως εφαρμόζεται στο METAL ¹⁵ ) οδήγησε σε ένα σημαντικό P _meta σε όλο το γονιδίωμα =2,67 × 10 ^-8 (OR=1,15, 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI): 1,08–1,21) όταν λαμβάνονται υπόψη μόνο οι κοόρτες σχιζοφρένειας και P _meta =9,49 × 10 ⁻¹² (OR=1,13; 95% CI: 1,08–1,17) όταν συμπεριλήφθηκαν όλες οι κοόρτες. Επιπλέον, η σημασία σε όλο το γονιδίωμα διατηρήθηκε όταν αποκλείστηκαν οι μη Καυκάσιες κοόρτες ( P _meta =8,62 × 10 ^-11 ). Λαμβάνοντας υπόψη μόνο τις κοόρτες μη ανακάλυψης, λήφθηκαν σημαντικά ανεξάρτητα στοιχεία για τη συσχέτιση του rs11098403 τόσο με τη σχιζοφρένεια ( P _rep =9,74 × 10 ^-4 ) όσο και με τη διπολική διαταραχή ( P _rep =5,40 × 10 ^-5 ). Όλες οι πρόσθετες κοόρτες κατέδειξαν αποτελέσματα στην ίδια κατεύθυνση με το αρχικό δείγμα ανακάλυψης (δοκιμή προσδόκιμου P =4,88 × 10 ⁻⁴ ), αποδίδοντας μια ισχυρά σημαντική συνολική αντιγραφή ( P _rep =1,46 × 10 ^-7 , OR=1,09, 95% CI: 1.04–1.14), με τρεις κοόρτες να επιδεικνύουν ανεξάρτητα την ονομαστική σημασία. Οι στατιστικές δοκιμές ετερογένειας μεταξύ όλων των μη-ανακαλυπτικών κοορτών, ανεξαρτήτως εθνικότητας ή διάγνωσης, ήταν ουσιαστικά μηδενικές ( Q =3,16, P =0,977, I ² =0,00%). Για περαιτέρω έλεγχο για ετερογένεια κοόρτης, επαναλάβαμε τη μετα-ανάλυση αφαιρώντας μία από τις ανεξάρτητες κοόρτες κάθε φορά. Σε αυτές τις 11 αναλύσεις, οι _{μετα -τιμές} P δεν παρουσιάζουν μεγάλη διαφορά από το συνολικό αποτέλεσμα, με εύρος από 8,10 × 10 ⁻¹² (όταν εξαιρέθηκε η κοόρτη σχιζοφρένειας MGS) έως 1,71 × 10 ⁻¹⁰ (όταν εξαιρείται το πολικό Ασκεντάζι ).

Οι τιμές P δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας λογιστική παλινδρόμηση στο προσθετικό μοντέλο και παρουσιάζονται σε παρενθέσεις. Οι ράβδοι σφαλμάτων αντιπροσωπεύουν το διάστημα εμπιστοσύνης 95% των αναλογιών πιθανοτήτων.

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Πιθανός ρυθμιστικός ρόλος του rs11098403 στο NDST3

Καθώς το rs11098403 δεν εμπίπτει στο ίδιο μπλοκ LD με το NDST3 (ή οποιοδήποτε άλλο γονίδιο) σε οποιονδήποτε πληθυσμό, λάβαμε αρκετές σειρές αποδεικτικών στοιχείων που υποστηρίζουν μια ρυθμιστική σχέση μεταξύ αυτού του SNP και του NDST3 . Πιο συγκεκριμένα, δεδομένα που προέρχονται από μεταθανάτιο παρεγκεφαλιδικό ιστό (συνολικά n = 119, που αποτελούνταν από 39 ασθενείς με σχιζοφρένεια, 36 με διπολική διαταραχή και 44 υγιείς μάρτυρες) έδειξαν σημαντική σχέση μεταξύ της κατάστασης του φορέα αλληλόμορφου κινδύνου στο rs11098403 και της διορθωμένης με SVA έκφραση του NDST3 χρησιμοποιώντας λογιστική παλινδρόμηση υπό το προσθετικό μοντέλο ( P =8,4 × 10 ⁻⁴ , Σχ. 5 ). Οι φορείς του αλληλόμορφου κινδύνου είχαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση σε σύγκριση με τους ομοζυγώτες για το κοινό αλληλόμορφο. Επιπλέον, όλα τα SNP εντός του μπλοκ LD που περιέχουν rs11098403 (hg18; Chr4: 118,7–119,0 MB) επιδεικνύουν ονομαστικά σημαντική συσχέτιση με τα επίπεδα έκφρασης NDST3 (όλα P <0,01 χρησιμοποιώντας λογιστική παλινδρόμηση, προσθετικό μοντέλο) και η υπό όρους ανάλυση δεν δείχνει δευτερεύουσες πηγές σήμα εντός της περιοχής ( Εικ. 5 ). Αν και το ισχυρότερο στατιστικό σήμα παρατηρήθηκε σε ένα γειτονικό SNP (rs17862991, το οποίο είναι 2.801 bp από το rs11098403), το ακριβές λειτουργικό στοιχείο δεν μπορεί να ανακτηθεί από αυτήν την ανάλυση λόγω των επιδράσεων του LD.

Οι συσχετίσεις εντός του μπλοκ LD που περιέχει το rs11098403 δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας λογιστική παλινδρόμηση στο προσθετικό μοντέλο. Τρεις γραφικές παραστάσεις παρουσιάζονται στην ίδια κλίμακα για αυτές τις αναλύσεις eQTL. Οι ακατέργαστες (χωρίς συνθήκες) τιμές P εμφανίζονται με μπλε, οι τιμές P που ρυθμίζονται σε rs11098403 (συντεταγμένες hg18) εμφανίζονται με πράσινο και οι τιμές P που ρυθμίζονται ξεχωριστά στο rs17862991 εμφανίζονται με κόκκινο.

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε σημαντική σχέση μεταξύ του rs11098403 και οποιασδήποτε από τις άλλες οκτώ μεταγραφές που είναι διαθέσιμες στους πίνακες έκφρασης μέσα σε ένα παράθυρο 3-MB με κέντρο αυτό το SNP (όλες οι αναλύσεις λογιστικής παλινδρόμησης προσθετικών μοντέλων P >0,3). Το αποτέλεσμα eQTL στο NDST3 παρέμεινε σημαντικό όταν εξετάστηκε μόνο η ομάδα ελέγχου ( n =44) ( P =0,002), υποδεικνύοντας ότι η συσχέτιση του γονότυπου με την έκφραση δεν αποτελεί τεχνούργημα ψυχιατρικής κατάστασης ή φαρμακευτικής αγωγής. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας ανάλυση συνδιακύμανσης, δεν υπήρξαν σημαντικές κύριες επιδράσεις της διαγνωστικής ομάδας ( Ρ = 0,801) και καμία αλληλεπίδραση της διαγνωστικής ομάδας και του γονότυπου ( Ρ = 0,902, Συμπληρωματικό Σχήμα S4 ).

Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση in silico του μπλοκ LD που περιβάλλει το rs11098403. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 6 , το rs11098403 εμφανίζεται σε μια διατηρημένη περιοχή που επικαλύπτει θέσεις ενισχυτή ENCODE (H3K4Me1, γκρι και μπλε βέλη στο Σχήμα 6 ). Επιπλέον, ένας κοντινός διακομιστής μεσολάβησης SNP rs17862077 (2.953 bp τελομερές έως rs11098403; r ² = 0,96 σε 1.000 Genomes CEU), γειτονεύει με ένα μη μεθυλιωμένο νησί CpG (κόκκινο βέλος), το οποίο είναι ασυνήθιστο στο διαγονιδιακό παράθυρο ( Spp.5 ). Τέλος, το RNA-seq που εκτελέστηκε σε μεταθανάτιο ιστό ιππόκαμπου ( n = 31 δείγματα ανθρώπου, 20 μακάκου και 16 αρουραίων) εντόπισε ένα νέο, μη κωδικοποιητικό αντίγραφο δίπλα στο rs11098403 που εκφράζεται σταθερά σε κάθε μεμονωμένο ανθρώπινο δείγμα ( Σχήμα 7 εμφανίζει το σήμα συγκεντρωμένο σε όλα δείγματα Το Σχ. 8 συγκρίνει τα αποτελέσματά μας με δημόσια διαθέσιμα κομμάτια έκφρασης UCSC). Αν και εκφράζεται πολύ ασθενώς σε κάθε άτομο για να πραγματοποιηθεί ανάλυση eQTL, είναι αξιοσημείωτο ότι αυτό το αντίγραφο δείχνει σημαντική ομολογία αλληλουχίας (1.034 νουκλεοτίδια που εκτείνονται σε μια περιοχή 3-kb) με μια παραλλαγή ματίσματος του NDST3 που σχολιάζεται από το Ensembl ως διατηρημένο εσώνιο (ENST0048003;4;4. Εικ. 9 ); Τα διατηρημένα εσώνια είναι γνωστό ότι επηρεάζουν τη σχετική έκφραση των πρωτογενών και εναλλακτικών μεταγραφών των γονιδίων ¹⁶ .

Ένα σημάδι ενεργοποίησης H3K4me1 σε αυτόν τον τόπο παρατηρείται σε ανθρώπινες εμβρυϊκές κυτταρικές σειρές Η1 (γκρι βέλος). Ένας κοντινός διακομιστής μεσολάβησης SNP (rs17862077, το οποίο είναι τελομερές 2.953 bp σε rs11098403; r ² =0,96 σε 1.000 Genomes CEU), γειτονεύει με ένα μη μεθυλιωμένο νησί CpG (κόκκινο βέλος), το οποίο είναι η μόνη τέτοια τοποθεσία μέσα σε ένα διαγονιδιακό παράθυρο 850-k. Πρόσθετα SNP με την ίδια σχέση LD με το rs11098403 (για παράδειγμα, rs11562906) εντοπίζονται σε ένα σημάδι H3K4me1 που ανιχνεύεται στον ιππόκαμπο (μπλε βέλος).

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Αντιπροσωπεύονται γονιδιωματικά χαρακτηριστικά στη συνθετική περιοχή του 1 Mb γύρω από το ανθρώπινο rs11098403. Τα κουτιά TATA προβλέφθηκαν από το TSSG (Softberry Inc) και οι προβλεπόμενες θέσεις του κουτιού TATA απεικονίστηκαν με κατακόρυφα βέλη (κόκκινο στο συν κλώνο και μπλε στο μείον κλώνο του χρωμοσώματος 4). Στην ευθυγράμμιση αλληλουχιών γονιδιώματος μεταξύ ειδών, η υψηλή ομοιότητα αλληλουχίας απεικονίστηκε με κόκκινο (ίδιος προσανατολισμός) και μπλε (αντίθετος προσανατολισμός). χαμηλή ομοιότητα ακολουθίας απεικονίστηκε σε κυανό. Οι πράσινες γραμμές με βέλη αντιπροσωπεύουν τη θέση και τον προσανατολισμό των επαναλαμβανόμενων ακολουθιών γύρω από το rs11098403. το πράσινο οριζόντιο βέλος στο κάτω πλαίσιο αντιστοιχεί στο αριστερό πράσινο βέλος στον παραπάνω πίνακα.

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Τα δεδομένα έκφρασης παρατηρήθηκαν σε δημόσια διαθέσιμα κομμάτια προγράμματος περιήγησης UCSC. Υπάρχει κάποια επικάλυψη με μικρές μεταγραφές που παρατηρήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες του εγκεφάλου, αλλά όχι άλλων ιστών.

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Η νέα μεταγραφή (που παρατηρείται στο Σχ. 7 ) επιδεικνύει σημαντική ομολογία (κόκκινο) με μια παραλλαγή εσωνίου που περιλαμβάνεται (ανοιχτό μπλε) του NDST3 .

Εικόνα πλήρους μεγέθους

Το NDST3 κωδικοποιεί τη Ν -δεακετυλάση/ Ν -σουλφοτρανσφεράση (ηπαράνη γλυκοζαμινυλ) 3, ένα ένζυμο που βρίσκεται στη συσκευή Golgi, το οποίο βοηθά στον καθορισμό των ιδιοτήτων δέσμευσης του HS ¹⁷ . Το NDST3 εκφράζεται τόσο στον εμβρυϊκό όσο και στον ενήλικο εγκέφαλο, με την υψηλότερη αφθονία στον ιππόκαμπο και την παρεγκεφαλίδα ¹⁸ . Το νοκ-άουτ αυτού του γονιδίου σε ποντίκια έχει ως αποτέλεσμα ουσιαστικά μειωμένη θείωση του HS στον φλοιό, αλλά παραδόξως αυξημένη Ν-, 6-Ο- και 2-Ο-θείωση στην παρεγκεφαλίδα, πιθανώς λόγω της αντισταθμιστικής δραστηριότητας άλλων ενζύμων σουλφοτρανσφεράσης ¹⁹ . Οι υποτύποι HS έχουν ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες, δρώντας ως συν-υποδοχείς για πολλαπλά μόρια αυξητικού παράγοντα ²⁰ . Έτσι, η ανώμαλη θείωση του HS θα μπορούσε να έχει ρόλο σε πολλές κρίσιμες νευροαναπτυξιακές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης νευρίτη ²¹ , της καθοδήγησης άξονα ²² και του σχηματισμού συνάψεων ²³ . Οι διαφορικά θειωμένες πρωτεογλυκάνες HS έχουν ποικίλα πρότυπα σύνδεσης με τη νευρεγουλίνη-1 (NRG1), μεταβάλλοντας έτσι την κατανομή του NRG1 και τη σηματοδότηση του erbB4 στο νευρικό σύστημα ²⁴ . συγκλίνουσες γραμμές αποδεικτικών στοιχείων εμπλέκουν ανωμαλίες σηματοδότησης NRG1/erbB4 τόσο στη σχιζοφρένεια όσο και στη διπολική διαταραχή ²⁵ .

Αν και οι περισσότερες μελέτες GWAS διεξάγονται σε εξωγαμικούς πληθυσμούς ευρωπαϊκής καταγωγής, η εξέταση εναλλακτικών πληθυσμών ήταν μια επιτυχημένη στρατηγική για τον εντοπισμό νέων αλληλόμορφων κινδύνου ^{26 , 27} . Η χρήση από εμάς ενός ιδρυτικού πληθυσμού μπορεί να είχε ως αποτέλεσμα ένα ισχυρότερο αποτέλεσμα από ό,τι παρατηρείται συνήθως στις κοόρτες ανακάλυψης GWAS στην ψυχιατρική. Αν και η στατιστική σημασία ενισχύθηκε, εν μέρει, από τη μεγαλύτερη συχνότητα ελάσσονος αλληλόμορφου που παρατηρήθηκε για το rs11098403 στον γενικό πληθυσμό AJ σε σύγκριση με όλους τους άλλους πληθυσμούς, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν επίσης αυξημένη διείσδυση του αλληλόμορφου κινδύνου σε πληθυσμούς AJ, με σχετικά μεγάλη ανακάλυψη. . Καθώς τα αποτελέσματα GWAS γενικά υπερεκτιμώνται σε κοόρτες ανακάλυψης (η λεγόμενη «κατάρα του νικητή»), εφαρμόσαμε μια μέθοδο διόρθωσης προκατάληψης ²⁸ στην εκτίμηση του μεγέθους του αποτελέσματος ανακάλυψης. Η διορθωμένη εκτίμηση OR που λήφθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο δύο σταδίων ήταν 1,34 (95% CI: 1,20–1,45) και ο εκτιμητής σταθμισμένου μέσου τετραγώνου σφάλματος (MSE) που λαμβάνει υπόψη την υπερδιόρθωση ήταν 1,37 (95% CI: 1,26–1,48). Σημειωτέον, η κοόρτη αναπαραγωγής Ashkenazi παρείχε επίσης μεγαλύτερο μέγεθος εφέ από όλες τις κοόρτες αναπαραγωγής που δεν ήταν AJ.

Αυξημένα μεγέθη επίδρασης για συγκεκριμένους τόπους GWAS έχουν αναφερθεί σε κοόρτες Ashkenazi σε τουλάχιστον δύο άλλες πολύπλοκες ασθένειες: rs2180341 ( RNF146 ) στον καρκίνο του μαστού ²⁹ και rs2076756 ( NOD2 ) σε Crohn’s ³⁰ . Αυτό το φαινόμενο μπορεί να σχετίζεται με τη μοναδική δημογραφική ιστορία των Ασκεναζίμ, η οποία χαρακτηρίστηκε από μια ακραία συμφόρηση που ακολουθήθηκε από εξαιρετικά γρήγορη επέκταση ^{31 , 32} . Ένα τέτοιο ιστορικό μπορεί να οδηγήσει σε μπλοκ ενισχυμένης LD σε σχέση με πληθυσμούς εξωγαμικής φυλής και η ενισχυμένη LD μπορεί να αυξήσει την αποτελεσματικότητα του GWAS για την επισήμανση μιας αιτιολογικής παραλλαγής ³³ . Στα δεδομένα μας, υπάρχουν ~50% περισσότερα ζεύγη SNP με μέτρια ή ισχυρότερη LD εντός 500 kb του rs11098403 στο AJ (191 ζεύγη SNP με r ² ≥0,5) σε σύγκριση με δείγματα CEU (μόνο 123 τέτοια ζεύγη). Επιπλέον, ο μέσος όρος LD αυτών των ζευγών SNP είναι σημαντικά μεγαλύτερος στην κοόρτη AJ (ζευγοποιημένο t -test=4,991; P =1 × 10 ^-6 ; Συμπληρωματικό Σχήμα S6 ). Επιπλέον, οι AJ είναι σχετικά πιο ομοιογενείς από τον γενικό πληθυσμό του Καυκάσου ³⁴ , με μειωμένη γενετική παραλλαγή υποβάθρου ³⁵ . Ενισχυμένα μεγέθη επίδρασης GWAS έχουν αναφερθεί σε άλλους ομοιογενείς και/ή απομονωμένους πληθυσμούς ^{36 , 37} .

Η συνέπεια των αποτελεσμάτων τόσο στη σχιζοφρένεια όσο και στη διπολική διαταραχή υποστηρίζει ένα αυξανόμενο σύνολο στοιχείων ότι τα τρέχοντα διαγνωστικά όρια στην ψυχιατρική νοσολογία δεν είναι βιολογικά έγκυρα ^{5 , 8} . Αν και γονίδια τροποποίησης που επηρεάζουν συγκεκριμένα κλινικά χαρακτηριστικά του φαινοτύπου μπορεί να εντοπιστούν από μελλοντική έρευνα, η παραλλαγή του NDST3 φαίνεται να προδιαθέτει για σοβαρή ψυχιατρική νόσο με ποικίλες εκδηλώσεις.

Περιγραφή κοόρτης ανακάλυψης

Δείγματα περίπτωσης ( n =1.156) και ελέγχου ( n =2.279) επιλέχθηκαν από ένα εβραϊκό αποθετήριο Ashkenazi (Hebrew University Genetic Resource, HUGR, http://hugr.huji.ac.il ). Ασθενείς για ανάλυση ανακάλυψης στρατολογήθηκαν από νοσηλευόμενους εσωτερικούς ασθενείς σε επτά ιατρικά κέντρα στο Ισραήλ. Όλες οι διαγνώσεις ανατέθηκαν μετά από άμεση συνέντευξη χρησιμοποιώντας τη δομημένη κλινική συνέντευξη (SCID) ³⁸ , ένα ερωτηματολόγιο με κριτήρια ένταξης και αποκλεισμού και παραπομπές σε ιατρικά αρχεία. Τα κριτήρια συμπερίληψης όριζαν ότι τα άτομα έπρεπε να διαγνωστούν με σχιζοφρένεια ή σχιζοσυναισθηματική διαταραχή από το Διαγνωστικό και Στατιστικό Εγχειρίδιο Ψυχικών Διαταραχών (DSM-IV), ότι και οι τέσσερις παππούδες κάθε υποκειμένου αναφέρθηκαν από το υποκείμενο ότι ήταν εβραϊκής καταγωγής Ασκενάζι. και ότι κάθε υποκείμενο ή ο νόμιμος εκπρόσωπος του υποκειμένου έχει υπογράψει το έντυπο συγκατάθεσης κατόπιν ενημέρωσης. Τα κριτήρια αποκλεισμού εξάλειψαν τα άτομα που είχαν διαγνωστεί με τουλάχιστον μία από τις ακόλουθες διαταραχές: ψυχωτική διαταραχή λόγω γενικής ιατρικής κατάστασης, ψυχωτική διαταραχή που προκαλείται από ουσίες ή οποιαδήποτε διαταραχή προσωπικότητας ομάδας Α (σχιζοτυπική, σχιζοειδής ή παρανοϊκή). Δείγματα από υγιή άτομα Ασκενάζι συλλέχθηκαν από εθελοντές στην Ισραηλινή Τράπεζα Αίματος. Αυτά τα άτομα δεν υποβλήθηκαν σε ψυχιατρικό έλεγχο, αλλά δεν ανέφεραν χρόνια νόσο και δεν έπαιρναν φάρμακα κατά τη στιγμή της αιμοληψίας. Οι αντίστοιχες θεσμικές επιτροπές αναθεώρησης και η Εθνική Γενετική Επιτροπή του Υπουργείου Υγείας του Ισραήλ ενέκριναν τις μελέτες. Όλα τα δείγματα ανωνυμοποιήθηκαν πλήρως αμέσως μετά τη συλλογή και στη συνέχεια, το γονιδιωματικό DNA εξήχθη από δείγματα αίματος μέσω της χρήσης του κιτ Nucleon (Pharmacia). Ο γονότυπος και οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν βάσει πρωτοκόλλων που έχουν εγκριθεί από το Συμβούλιο Θεσμικής Αναθεώρησης του Συστήματος Υγείας North Shore-LIJ.

Γονότυπος και ποιοτικός έλεγχος

Ο γονότυπος πραγματοποιήθηκε για περίπου 1 εκατομμύριο SNP σε όλο το γονιδίωμα χρησιμοποιώντας συστοιχίες Illumina HumanOmni1-Quad σύμφωνα με τις προδιαγραφές των κατασκευαστών. Όπως απεικονίζεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S1 , τα SNP φιλτράρονταν στις ακόλουθες βάσεις: ρυθμός κλήσης <98%, ελάχιστη συχνότητα αλληλόμορφων <0,02 και ακριβής δοκιμή Hardy–Weinberg P <0,000001 στους μάρτυρες. Τα δείγματα φιλτραρίστηκαν με βάση τη διήθηση ποιοτικού ελέγχου γονότυπου (ποσοστό κλήσης δείγματος <97%, αναντιστοιχία φύλου) και εξετάστηκαν για κρυπτική ταυτότητα και συσχέτιση πρώτου ή δεύτερου βαθμού χρησιμοποιώντας εκτίμηση κατά ζεύγη ταυτότητα προς αξιοπρεπή (PI_HAT) στο PLINK ³⁹ με 128.403 LD κλαδευμένα ( r ² >0,2) SNP σε όλο το γονιδίωμα. Τα δείγματα εξαιρέθηκαν με βάση το PI_Hat>0,125. Το άτομο με χαμηλότερο ποσοστό κλήσης από κάθε ζεύγος ελέγχου/μάρτυρα ή περίπτωσης/υπόθεσης αποκλείστηκε και οι έλεγχοι αποκλείστηκαν από ζεύγη περιπτώσεων/μάρτυρες.

Αυτά τα εναπομείναντα δείγματα εξετάστηκαν περαιτέρω ως προς την υποκείμενη διαστρωμάτωση του πληθυσμού χρησιμοποιώντας ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) με ενημερωτικούς δείκτες καταγωγής ειδικούς για τον εβραϊκό πληθυσμό Ασκενάζι ³⁵ . Δείγματα με αποτελέσματα PCA που υποδηλώνουν έναν ή περισσότερους παππούδες και γιαγιάδες που δεν ήταν AJ αναγνωρίστηκαν ως ακραίες τιμές με βάση τη βαθμολογία πρώτης κύριας συνιστώσας >0,01 και εξαιρέθηκαν από περαιτέρω ανάλυση ( n =607).

Στατιστική ανάλυση

Η αλληλική συσχέτιση μεταξύ κάθε SNP και του κινδύνου σχιζοφρένειας αξιολογήθηκε με χρήση λογιστικής παλινδρόμησης στο πλαίσιο του προσθετικού μοντέλου, η οποία ποικίλλει για τα δύο πρώτα συστατικά που προέρχονται από ανάλυση κύριων συστατικών σε όλο το γονιδίωμα. μόνο οι δύο πρώτοι υπολογιστές έφεραν ιδιοτιμές >1 ( Συμπληρωματικό Σχήμα S2 ). Αυτές οι αναλύσεις εφαρμόστηκαν σε λογισμικό SVS7 (Golden Helix, Inc., Bozeman, ΜΤ). Το όριο για τη σημασία σε όλο το γονιδίωμα καθορίστηκε στο P <6,56 × 10 ⁻⁸ με βάση μια αυστηρή διόρθωση Bonferroni για 762.372 δοκιμές σε α =0,05, το οποίο μπορεί να θεωρηθεί συντηρητικό δεδομένου ότι οι δοκιμές των συνδεδεμένων SNP δεν είναι ανεξάρτητες ⁴⁰ . Η ανάλυση EMMAX ⁴¹ διεξήχθη χρησιμοποιώντας διόρθωση για ταυτότητα ανά κράτος, καθώς και τα ίδια 2 κύρια στοιχεία με τις συμμεταβλητές. Η ανάλυση υπό όρους για τον έλεγχο των επιδράσεων του κορυφαίου SNP στην περιοχή διεξήχθη στο PLINK.

Ανάλυση τεκμαρτών

Πραγματοποιήσαμε ανάλυση τεκμαρτών για να προσδιορίσουμε την πλήρη έκταση της συσχετισμένης περιοχής και να ελέγξουμε για τυχόν μη τυποποιημένες παραλλαγές με ισχυρότερους συσχετισμούς από αυτές που είναι διαθέσιμες στην αρχική πλατφόρμα Illumina GWAS. Μετά την προ-φασική επεξεργασία των αρχικών δεδομένων χρησιμοποιώντας το SHAPEIT ⁴² , πραγματοποιήθηκε καταλογισμός σε όλο το γονιδίωμα χρησιμοποιώντας το IMPUTE2 ⁴³ χρησιμοποιώντας τον κοσμοπολίτικο πίνακα αναφοράς HapMap3 ( n =1.011 άτομα από την Αφρική, την Ασία, την Ευρώπη και την Αμερική). Δοκιμές συσχέτισης (προσθετικό μοντέλο, χρησιμοποιώντας τις ίδιες δύο συμμεταβλητές PCA που περιγράφονται παραπάνω) πραγματοποιήθηκαν σε τεκμαρτές δόσεις γονότυπου χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα SNPTEST εντός του πλαισίου IMPUTE2 σε συνολικά 1.622.655 SNPs. Από αυτά, 70.330 SNP ήταν μονόμορφα και δεν εξετάστηκαν περαιτέρω.

Κοόρτες αντιγραφής και μετα-ανάλυση

Εξετάσαμε τη συσχέτιση του κορυφαίου SNP από την κοόρτη ανακάλυψης σχιζοφρένειας σε έξι ανεξάρτητες κοόρτες σχιζοφρένειας μη-Ασκενάζι και τέσσερις διπολικές κοόρτες περιπτώσεων ελέγχου μη-Ασκενάζι, καθώς και σε μία κοόρτη διπολικής περίπτωσης-μάρτυρα Ασκενάζι, που περιλαμβάνει 23.191 άτομα, όπως περιγράφεται στον Πίνακα 1 και στη Συμπληρωματική Σημείωση 1 . Καθεμία από τις κοόρτες αναπαραγωγής που δεν είναι Ασκενάζι προέρχονται από δημοσιευμένες, αξιολογημένες μελέτες και όλα τα θέματα παρείχαν γραπτή, ενημερωμένη συγκατάθεση σε μελέτες που διεξήχθησαν σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και εγκρίθηκαν από τις τοπικές επιτροπές δεοντολογίας. Το κορυφαίο συνδεδεμένο SNP από την κοόρτη ανακάλυψης γονότυπος προσδιορίστηκε απευθείας (δεν καταλογίστηκε) σε εννέα κοόρτες αναπαραγωγής χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες πλατφόρμες. Affymetrix 6.0, Affymetrix 500 k και Illumina Hap550. Για δύο κοόρτες (Μόναχο και Αμπερντίν), το SNP κορυφαίας ανακάλυψης δεν ήταν διαθέσιμο, επομένως το πλησιέστερο SNP (rs1870482, r ² =0,95 στον πληθυσμό HapMap2 CEU) χρησιμοποιήθηκε ως πληρεξούσιος. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το προσθετικό μοντέλο.

Πραγματοποιήθηκε μετα-ανάλυση μεταξύ των κοορτών με βάση τη σταθμισμένη μέθοδο Z -score χρησιμοποιώντας το METAL ¹⁵ . Όπως περιγράφηκε σε προηγούμενη μετα-ανάλυση GWAS ^{10 , 44 , 45} , οι τιμές P για κάθε κοόρτη αναπαραγωγής αναφέρονται ως δοκιμές μίας ουράς, ενώ οι τιμές P για όλες τις συνδυασμένες αναλύσεις αναφέρονται ως δοκιμές δύο ουρών. Πριν από τη μετα-ανάλυση στο METAL, οι τιμές P για κάθε κοόρτη αντιγραφής μετατράπηκαν σε z -scores όπως περιγράφεται από τους Nyholt et al. ⁴⁵ Η ετερογένεια μεταξύ των ομάδων ήταν προσβάσιμη από τα στατιστικά Q Cochran και I ² . Πρέπει να τονιστεί ότι καμία κοόρτη αναπαραγωγής δεν εξετάστηκε και στη συνέχεια αποκλείστηκε για οποιονδήποτε λόγο. Δεν αναζητήθηκαν περαιτέρω κοόρτες αναπαραγωγής, πέρα ​​από τις έντεκα που αναφέρθηκαν, λόγω της σχετικής σταθερότητας της εκτίμησης παραμέτρων: δεδομένου ότι το συνδυασμένο σύνολο των 25.735 υποκειμένων μας απέδωσε τιμή P περίπου τρεις τάξεις μεγέθους πέρα ​​από το συμβατικό όριο στατιστικής σημασίας, μια περαιτέρω Ο διπλασιασμός του συνολικού μεγέθους δείγματος θα μείωνε το διάστημα εμπιστοσύνης 95% του OR κατά μόλις 0,01 μονάδες σε κάθε άκρο.

Ανάλυση κατάρας νικητών

Προκειμένου να προσαρμοστούμε για πιθανή μεροληψία επιλογής, που συνήθως αναφέρεται ως κατάρα του νικητή, χρησιμοποιήσαμε μια υπό όρους προσέγγιση μέγιστης πιθανότητας ²⁸ , στην οποία μια διορθωμένη εκτίμηση OR προκύπτει χρησιμοποιώντας την ασυμπτωτική προσέγγιση στη συνάρτηση πυκνότητας υπό όρους πιθανότητας της εκτίμησης log OR μετά επιλογή. Αυτή η εκτίμηση OR υποβάλλεται στη συνέχεια σε έναν σταθμισμένο εκτιμητή MSE, για να ληφθεί υπόψη η πιθανή υπερδιόρθωση της διορθωμένης εκτίμησης. Για να απομονώσουμε τα αποτελέσματα της κατάρας του νικητή από τα ειδικά για τον πληθυσμό αποτελέσματα που μπορεί να διαφοροποιούν τις κοόρτες AJ, θεωρήσαμε την κοόρτη ανακάλυψης AJ ως το πρώτο στάδιο και την κοόρτη αναπαραγωγής AJ ως το δεύτερο στάδιο σε ένα σχεδιασμό δύο σταδίων. Ο σταθμισμένος εκτιμητής MSE λήφθηκε ως ένας γραμμικός συνδυασμός εκτιμήσεων OR από την κοόρτη ανακάλυψης AJ και τη διορθωμένη εκτίμηση OR. Όλοι οι υπολογισμοί έγιναν χρησιμοποιώντας κωδικούς R που ελήφθησαν από τους συγγραφείς της μεθόδου ²⁸ .

Ανάλυση LD

Τυχαία επιλεγμένοι έλεγχοι Ashkenazi ( n =60) και 60 δείγματα ιδρυτή CEU HapMap χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση της δομής LD στην περιοχή των 500 kb που περιβάλλει το rs11098403. Για λόγους σύγκρισης, εξετάστηκαν μόνο τα SNP που είχαν γονότυπο απευθείας και στα δύο δείγματα.

Ανάλυση συσχέτισης γονότυπου-έκφρασης

Για να προσδιορίσουμε τη λειτουργική επίδραση του SNP που σχετίζεται με την ασθένεια, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη γονιδιακής έκφρασης σε ένα σύνολο μεταθανάτιων δειγμάτων εγκεφάλου που ελήφθησαν από το Stanley Medical Research Institute (SMRI). Ο παρεγκεφαλιδικός ιστός ελήφθη από 119 Καυκάσια άτομα, συμπεριλαμβανομένων ασθενών με διάγνωση σχιζοφρένειας ( n =39), διπολική διαταραχή ( n =36) και δωρητών χωρίς ψυχιατρική νόσο ( n =44). Οι διαγνώσεις των δειγμάτων έγιναν από δύο ανώτερους ψυχιάτρους, χρησιμοποιώντας τα κριτήρια DSM-IV και βασίστηκαν σε ιατρικά αρχεία, και, όταν ήταν δυνατόν, τηλεφωνικές συνεντεύξεις με μέλη της οικογένειας. Οι διαγνώσεις μη επηρεαζόμενων ελέγχων βασίστηκαν σε δομημένες συνεντεύξεις από ανώτερο ψυχίατρο με μέλη της οικογένειας για να αποκλειστούν οι διαγνώσεις του Άξονα-Ι. Όλα τα δείγματα έχουν δεδομένα ηλικίας, φύλου, μεταθανάτιο διάστημα (PMI), pH εγκεφάλου, χρήση καπνίσματος και αλκοόλ, κατάσταση αυτοκτονίας και αντιψυχωσικά φάρμακα.

Το γονιδιωματικό DNA εξήχθη από κατεψυγμένους παρεγκεφαλιδικούς ιστούς που παρέχονται από το SMRI. Τροποποιήθηκε και ακολουθήθηκε πρωτόκολλο φαινόλης/χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης. Το DNA επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα EDTA ΤΕ 0,1 mM. Το γονιδιωματικό DNA αξιολογήθηκε με φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) για συγκέντρωση και με πήκτωμα αγαρόζης 1% για την επικύρωση της ακεραιότητας του DNA. Ο γονότυπος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Affymetrix GeneChip Mapping 5.0 Array and Assay Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο Affymetrix ⁴⁶ . Οι γονότυποι κλήθηκαν με τον αλγόριθμο BRLMM-p (Affymetrix) με όλους τους πίνακες ταυτόχρονα. Τα ποσοστά κλήσεων SNP κυμαίνονταν από 97,3–99,58% (μέσος όρος 98,9%).

Το συνολικό RNA εξήχθη από κατεψυγμένους παρεγκεφαλιδικούς ιστούς χρησιμοποιώντας το mini kit miRNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Η έκφραση γονιδίου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη σειρά Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο NIH Neuroscience Microarray Consortium στο Πανεπιστήμιο Yale. Τα ακατέργαστα αρχεία έκφρασης γονιδίου CEL υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από το λογισμικό Affymetrix Expression Console EC1.1.2 χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένα αρχεία βιβλιοθήκης χωρίς SNP. Τα εφέ παρτίδας αφαιρέθηκαν από το ComBat στο πακέτο R ⁴⁷ . Για την ανάλυση συσχέτισης γονότυπου-έκφρασης, χρησιμοποιήθηκε SVA ⁴⁸ για την αφαίρεση των επιδράσεων όλων των συγχυτικών συμμεταβλητών. Για τους σκοπούς της παρούσας μελέτης, εξετάσαμε τη σχέση των αλληλόμορφων από το κορυφαίο SNP που σχετίζεται με την ασθένεια με την έκφραση εννέα μεταγραφών που είναι διαθέσιμες στις συστοιχίες έκφρασης μέσα σε ένα παράθυρο 3 MB με κέντρο στο rs11098403. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις eQTL για να εξετάσουμε τη συσχέτιση μεταξύ του NDST3 και όλων των διαθέσιμων SNP ( n =40) εντός της περιοχής του σήματος GWAS (hg18; Chr4:118,7–119,0 MB). Για την ανάλυση της διαφορικής έκφρασης μεταξύ των ομάδων, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της ανάλυσης συνδιακύμανσης που περιλαμβάνει έξι παράγοντες (ηλικία, PMI, εγκεφαλικό_pH, κατάσταση στοργής, φύλο και αντιψυχωσικά) στο λογισμικό SPSS16.0 ( http://www.spss.com ). Για αυτές τις αναλύσεις, οι ετεροζυγώτες συνδυάστηκαν με τους ομοζυγώτες του αλληλόμορφου κινδύνου. Τα μεγέθη των κυττάρων ήταν πολύ μικρά για να επιτρέψουν τη μοντελοποίηση των προσθετικών αλληλικών επιδράσεων σε κάθε διαγνωστική ομάδα.

Προφίλ έκφρασης σε όλο το γονιδίωμα με χρήση τεχνολογίας RNA-seq

Ο μεταθανάτιος εγκεφαλικός ιστός (ιππόκαμπος) 31 ανθρώπων ελήφθη από το Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι Brain Endowment Bank (Μαϊάμι, Φλόριντα, ΗΠΑ). Ο μεταθανάτιος ιππόκαμπος 10 μακάκων ρέζους ελήφθη από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Ζώων στο Poolesville του Μέριλαντ. Ο ιστός του ιππόκαμπου από 16 αρουραίους ελήφθη από το εργαστήριο του Dr Howard Edenberg στο Πανεπιστήμιο της Ιντιάνα. Το πρωτόκολλο ανθρώπινης έρευνας για τις διαδικασίες που εμπλέκονται στη συλλογή μεταθανάτιου εγκεφάλου και σχετικών δεδομένων εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι. Τα πρωτόκολλα μελέτης Macaque εγκρίθηκαν από τις επιτροπές φροντίδας και χρήσης των ζώων NIAAA και NICHD. Τα πρωτόκολλα μελέτης αρουραίων εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Ιντιάνα.

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ~ 100 mg ιστού ιππόκαμπου και mRNA απομονώθηκε από 35 μg ολικού RNA με Dynabeads oligo (dT)25 (Invitrogen). Το καθαρισμένο mRNA κατακερματίστηκε στις 150-500 βάσεις με ανάμιξη με 10x ρυθμιστικό θραυσματοποίησης (Ambion, Austin, TX) και θέρμανση στους 70 °C για 3 λεπτά. Περίπου 200 ng κατακερματισμένου mRNA χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνθεση σύνθεσης cDNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο mRNAseq της Illumina. Το RNA-seq διεξήχθη για κάθε δείγμα ξεχωριστά σε έναν αναλυτή γονιδιώματος Illumina (Illumina, San Diego, CA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα Illumina με 36 κύκλους χρησιμοποιώντας τη μέθοδο «sequencing-by-synthesis». Οι αλληλουχίες κλήθηκαν από αρχεία εικόνας με το Illumina Genome Analyzer Pipeline (GApipeline) και ευθυγραμμίστηκαν με τα αντίστοιχα γονιδιώματα αναφοράς (UCSC hg18 για τον άνθρωπο, UCSC rheMac2 για μακάκο και UCSC rn4 για τον αρουραίο) χρησιμοποιώντας Extended Eland στο GApipeline. Οι μοναδικά χαρτογραφημένες αναγνώσεις (συνολικά 297,8 εκατομμύρια για τον άνθρωπο, 44,6 εκατομμύρια για τον μακάκο και 125,5 εκατομμύρια για τον αρουραίο) αναλύθηκαν με εσωτερικά σενάρια Perl για τη δημιουργία αρχείων WIG, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την προβολή του προφίλ έκφρασης με το UCSC Genome Browser. Όλες οι ακατέργαστες αλληλουχίες που δημιουργήθηκαν σε αυτήν τη μελέτη έχουν κατατεθεί στο Αρχείο Ανάγνωσης Ακολουθίας (NCBI) με τους αριθμούς πρόσβασης SRA028822 , SRA027316 , SRA029279 και SRA029275 .

Πώς να αναφέρετε αυτό το άρθρο: Lencz, T. et al. Μελέτη συσχέτισης σε επίπεδο γονιδιώματος εμπλέκει το NDST3 στη σχιζοφρένεια και τη διπολική διαταραχή. Nat. Commun. 4:2739 doi:10.1038/ncomms3739 (2013).