Εξωσώματα – Γεγονός ή Φαντασία; ( Για ποιά ιατρική επιστήμη μιλάμε;;; Για ποιά ΙΟΛΟΓΙΑ;;; ΓΙΑ ΠΟΙΟΝ ΚΟΡΟΝΟΪΟ;;;)

18 Αυγούστου, 2022 2 Από Καλλιόπη Σουφλή
Μοίρασέ το

 

Χρησιμοποιώντας το παράδειγμα της έρευνας των εξωσωμάτων, μπορούμε να δούμε ότι για τη συντριπτική πλειονότητα των 40 και πλέον ετών της ταχέως αναπτυσσόμενης έρευνας, δεν υπήρχαν τέτοιοι έλεγχοι ποιότητας.

Οι ερευνητές αφέθηκαν στην τύχη τους προκειμένου να παράγουν όποια πειραματικά δεδομένα εξυπηρετούσαν τις ανάγκες και τους σκοπούς τους.

Τα δεδομένα αυτά συλλέγονταν αλλά δεν επικυρώνονταν ποτέ.

Μια οντότητα “ανακαλύφθηκε” αλλά οι μέθοδοι που απαιτούνται για τον πλήρη διαχωρισμό των υποτιθέμενων σωματιδίων του εξωσώματος από οτιδήποτε άλλο δεν υπάρχουν.

Λόγω αυτής της αδυναμίας διαχωρισμού των εξωσωμάτων από τους “ιούς” και άλλα εξωκυτταρικά κυστίδια του ίδιου μεγέθους, σχήματος και πυκνότητας, ο χαρακτηρισμός και η λειτουργία αυτών των οντοτήτων παραμένει μη επαληθεύσιμη. 

Καθώς οι ίδιες μέθοδοι χρησιμοποιούνται για την “απομόνωση” των πανομοιότυπων σωματιδίων που είναι γνωστά ως “ιοί”, θα πρέπει επίσης να αμφισβητηθούν οι εργασίες των τελευταίων 70+ ετών για την ιολογία.

 

Διαβάζοντας το παρόν και το προηγούμενο αποκαλυπτικό άρθρο (εδώ), δεν μπορώ παρά να μην αναρωτηθώ:

ΓΙΑ ΠΟΙΑ ΙΑΤΡΙΚΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΜΙΛΑΜΕ;;;

ΓΙΑ ΠΟΙΑ ΙΟΛΟΓΙΑ;;; ΓΙΑ ΠΟΙΟΝ ΚΟΡΟΝΟΪΟ;;;

Γιατί αυτό, μόνον ΙΑΤΡΙΚΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ…

Καλλιόπη Σουφλή

Μετάφραση: Απολλόδωρος

7 Ιουλίου 2022, ViroLIEgy Διαβάστε το εδώ

____________

Προκειμένου να γνωρίζουμε αν τα στοιχεία που υποβάλλονται για οποιαδήποτε αόρατη οντότητα είναι αξιόπιστα, πρέπει να εξετάσουμε τις μεθόδους που χρησιμοποίησαν οι ερευνητές προκειμένου να επιτύχουν τα αποτελέσματά τους. Ακολούθησαν οι ερευνητές την επιστημονική μέθοδο; Ήταν οι διαδικασίες επικυρωμένες για τους προβλεπόμενους σκοπούς; Υπάρχουν τεχνολογικοί περιορισμοί που πρέπει να αντιμετωπιστούν; Εφάρμοσαν οι ερευνητές τους κατάλληλους ελέγχους για να συνυπολογίσουν όλες τις πιθανές συγχυτικές μεταβλητές; Είναι οι μέθοδοι τυποποιημένες σε όλα τα εργαστήρια που διεξάγουν τέτοιες έρευνες; Υποστηρίχθηκαν τα συμπεράσματα από τα αποδεικτικά στοιχεία και τα αποτελέσματα ήταν αναπαραγώγιμα και επαναλήψιμα;

Συχνά, όταν προσπαθεί κανείς να βρει απαντήσεις σε ερωτήματα όπως αυτά, συναντά μια λιτανεία δικαιολογιών για τους λόγους για τους οποίους οι τρέχουσες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι ανίκανες να υποστηρίξουν τα αποδεικτικά στοιχεία που λαμβάνονται. Σε πολλές περιπτώσεις, δίνεται η υπόσχεση ότι στο μέλλον θα υπάρχει καλύτερη τεχνολογία και ότι λαμβάνονται μέτρα για να εξασφαλιστεί η ποιότητα της έρευνας στο μέλλον. Ωστόσο, εάν οι τρέχουσες μέθοδοι και η τεχνολογία είναι ανεπαρκείς και η έρευνα δεν έχει τυποποίηση που οδηγεί σε ένα ελεύθερο πεδίο όπου κάθε εργαστήριο αφήνεται στις δικές του ατομικές συσκευές, πώς μπορούν να επικυρωθούν τα στοιχεία που παρουσιάζονται; Πώς μπορούν να προσδιοριστούν τα επιστημονικά γεγονότα από την επιστημονική φαντασία;

Στην περίπτωση των εξωσωμάτων, τα αποδεικτικά στοιχεία που υποβάλλονται για αυτές τις αόρατες οντότητες έχουν συσσωρευτεί με ταχείς ρυθμούς τα τελευταία σαράντα χρόνια. Η έρευνα έχει αναπτυχθεί τρομερά από τότε που αυτές οι οντότητες βρέθηκαν αρχικά χρησιμοποιώντας τις ίδιες πρακτικές κυτταροκαλλιέργειας που παρατηρούνται στην ιολογία. Έκτοτε, τα σωματίδια που θεωρούνται εξωσώματα έχουν υποστηριχθεί ότι έχουν βρεθεί σχεδόν σε όλα τα σωματικά υγρά. Τους έχουν αποδοθεί πολλές θεωρητικές λειτουργίες, όπως ο καθοριστικός ρόλος τους στη διακυτταρική επικοινωνία, καθώς και η παθολογική τους δράση που είναι πανομοιότυπη με αυτή των “ιών”. Στην πραγματικότητα, έχω δείξει ότι τα εξωσώματα είναι τα ίδια ακριβώς σωματίδια που ισχυρίζονται ότι είναι “ιοί” με τη μόνη διαφορά ότι τα εξωσώματα λέγεται ότι δεν μπορούν να αναπαραχθούν, πράγμα που είναι μια λειτουργία που δεν αποδείχθηκε ποτέ για τους “ιούς”.

Ακριβώς όπως και στην περίπτωση της ιολογίας, το πρόβλημα που αντιμετωπίζεται με την έρευνα των εξωσωμάτων είναι ότι, από την “ανακάλυψη” των εξωσωμάτων στις αρχές της δεκαετίας του 1980, έχει αποδειχθεί ότι οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση και τη μελέτη αυτών των σωματιδίων είναι εντελώς ανεπαρκείς. Οι διαδικασίες που χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό δεν είναι σε θέση να διαχωρίσουν τα εξωσώματα από τους “ιούς” καθώς και από άλλα εξωκυτταρικά κυστίδια και σωματίδια μη-EV που περιέχονται σε ένα δείγμα λόγω του παρόμοιου μεγέθους, σχήματος και πυκνότητας. Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για τον βιοχημικό και μοριακό χαρακτηρισμό είναι μη ειδικές και παραμένουν μια δύσκολη πρόκληση. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται για τις λειτουργίες αυτών των σωματιδίων έχουν τεθεί υπό αμφισβήτηση λόγω των ακατέργαστων, μολυσμένων και ετερογενών παρασκευασμάτων στα οποία υποτίθεται ότι περιέχονται τα εξωσώματα. Πολλά από τα χαρακτηριστικά και τις λειτουργίες που αποδίδονται σε αυτές τις φανταστικές οντότητες δεν μπορούν να επαληθευτούν πειραματικά.

Τα προβλήματα που αντιμετώπισαν οι ερευνητές των εξωσωμάτων οδήγησαν τη Διεθνή Εταιρεία Εξωκυτταρικών Σωματιδίων να εκδώσει το 2014 μια σειρά κατευθυντήριων γραμμών που είναι γνωστές ως Ελάχιστες Πληροφορίες για Μελέτες Εξωκυτταρικών Σωματιδίων (MISEV). Ήταν μια προσπάθεια να δοθεί καθοδήγηση για την τυποποίηση των πρωτοκόλλων και των εκθέσεων στον τομέα των εξωκυτταρικών κυστιδίων, ο οποίος υπήρχε για 30 και πλέον χρόνια χωρίς να υπάρχουν τέτοια κριτήρια. Στην εναρκτήρια δήλωση, οι συγγραφείς παραδέχθηκαν τη δυσκολία στην πραγματική απομόνωση των υπό μελέτη σωματιδίων προκειμένου να τα χαρακτηρίσουν και να προσδιορίσουν τη λειτουργία τους. Η έλλειψη τυποποιημένων διαδικασιών δημιουργούσε αναξιόπιστα αποτελέσματα. Έτσι, στόχευσαν να διορθώσουν αυτά τα ζητήματα παρέχοντας τις ελάχιστες απαιτήσεις που πρέπει να αντιμετωπιστούν για κάθε μελέτη:

“Είναι σημαντικό ότι επί του παρόντος είναι τεχνικά δύσκολο να ληφθεί ένα εντελώς καθαρό κλάσμα EV απαλλαγμένο από μη κυψελιδικά συστατικά για λειτουργικές μελέτες και, ως εκ τούτου, υπάρχει ανάγκη να θεσπιστούν κατευθυντήριες γραμμές για τις αναλύσεις αυτών των κυστιδίων και την υποβολή εκθέσεων επιστημονικών μελετών σχετικά με τη βιολογία των EV”.

Ο διαχωρισμός αυτών των μη κυψελιδικών οντοτήτων από τα EV δεν επιτυγχάνεται πλήρως με τα κοινά πρωτόκολλα απομόνωσης EV, συμπεριλαμβανομένων των πρωτοκόλλων φυγοκέντρησης ή των εμπορικών κιτ που ισχυρίζονται ότι απομονώνουν/καθαρίζουν EV ή “εξώσωμα”. Επίσης, η σύνθεση των ανακτημένων EV ποικίλλει σε μεγάλο βαθμό ανάλογα με τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται (6-8)”.

Αναγνωρίζουμε ότι τα διαφορετικά πειραματικά συστήματα, οι πηγές βιολογικών δειγμάτων, η εμπειρία των ερευνητών και τα χρησιμοποιούμενα όργανα συμβάλλουν στην ανομοιογένεια των δημοσιευμένων πρωτοκόλλων και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Ένα πλαίσιο για την παροχή δεδομένων και την απόδοση λειτουργιών στα EVs συζητήθηκε από την Εκτελεστική Επιτροπή της Διεθνούς Εταιρείας Εξωκυτταρικών Κυστιδίων (ISEV), μιας ομάδας επιστημόνων με συλλογική μακροχρόνια εμπειρία στον τομέα της βιολογίας των EVs. Εδώ προτείνουμε μια σειρά κριτηρίων, με βάση την τρέχουσα βέλτιστη πρακτική, που αντιπροσωπεύουν τον ελάχιστο χαρακτηρισμό των EVs που πρέπει να αναφέρουν οι ερευνητές. Η υιοθέτηση αυτών των κριτηρίων θα πρέπει να βοηθήσει τους ερευνητές στον προγραμματισμό των μελετών καθώς και στην αναφορά των αποτελεσμάτων τους. Επιπλέον, προτείνουμε κατάλληλους ελέγχους που θα πρέπει να περιλαμβάνονται στις λειτουργικές μελέτες που σχετίζονται με τα EV. Αυτοί οι έλεγχοι θα πρέπει να υποστηρίζουν τα συμπεράσματα σχετικά με τις λειτουργίες των EVs και τη σχέση τους με φυσιολογικούς και παθολογικούς μηχανισμούς”.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4275645/

Όπως παραδέχεται το MISEV2014, τα εξωσώματα δεν μπορούν να καθαριστούν και να απομονωθούν από άλλες βιολογικές ενώσεις ούτε να χαρακτηριστούν κατάλληλα, επομένως η εγκυρότητα οποιασδήποτε επιστημονικής μελέτης σχετικά με τα εξωσώματα τα τελευταία 40+ χρόνια, συμπεριλαμβανομένης της αρχικής μελέτης που έφερε την έννοια του εξωσώματος, θα πρέπει να αμφισβητηθεί ως προς την ακρίβειά της. Καθώς οι ίδιες μέθοδοι χρησιμοποιούνται για την “απομόνωση” των πανομοιότυπων σωματιδίων που είναι γνωστά ως “ιοί”, θα πρέπει επίσης να αμφισβητηθούν οι εργασίες των τελευταίων 70+ ετών για την ιολογία. Ωστόσο, αντί να εξετάσουν κριτικά τις προηγούμενες δεκαετίες έρευνας, οι ειδικοί συγκεντρώθηκαν και έθεσαν σε εφαρμογή ένα συμφωνημένο κριτήριο και μια καθοδήγηση, προκειμένου οι ερευνητές να “τα πάνε καλύτερα” στο μέλλον. Υπάρχει πάντα η υπόσχεση ότι τα αποτελέσματα και τα συμπεράσματα θα επαληθευτούν με την πρόοδο των μεθόδων και της τεχνολογίας, ενώ αγνοείται το πρόβλημα με τον τεράστιο όγκο συσσωρευμένων στοιχείων που έχει αποδειχθεί ότι έχουν οικοδομηθεί σε δόλια βάση. Αυτό δημιουργεί μια ψευδαίσθηση προόδου, ενώ στην πραγματικότητα τα πράγματα παραμένουν ακριβώς τα ίδια.

Έτσι, η ISEV έθεσε ως στόχο να επαναξιολογεί και να επικαιροποιεί τις κατευθυντήριες γραμμές της κάθε τέσσερα χρόνια, προκειμένου να καταγράφει τις όποιες εξελίξεις στον τομέα και να τις εφαρμόζει στις συστάσεις της. Αναθεώρησαν το MISEV το 2018, με την υπόσχεση ότι θα υπάρξει άλλη μια επικαιροποίηση φέτος. Οι διαφορές που διαπίστωσαν μέσα σε τέσσερα χρόνια ήταν ελάχιστες. Παρά τις τεχνολογικές εξελίξεις, τα εξωσώματα εξακολουθούσαν να μην μπορούν να καθαριστούν και να απομονωθούν από οτιδήποτε άλλο. Στην πραγματικότητα, η ISEV παραδέχθηκε ότι αυτό ήταν αδύνατο. Αυτή η αδυναμία διαχωρισμού των σωματιδίων καθιστούσε τον χαρακτηρισμό τους μια δύσκολη πρόκληση. Οι λειτουργίες που αποδίδονταν στα EVs δεν μπορούσαν να επαληθευτούν πειραματικά λόγω της ακόμη περιορισμένης γνώσης των συγκεκριμένων μοριακών μηχανισμών βιογένεσης και απελευθέρωσής τους. Λόγω των διαφορετικών προσεγγίσεων που εφαρμόστηκαν κατά τη διάρκεια διαφορετικών μελετών, η MISEV2018 δεν πρότεινε μοριακούς δείκτες που θα μπορούσαν να χαρακτηρίσουν ειδικά κάθε υποτύπο EV. Επίσης, δεν προτάθηκε ως κύριο σημείο κάθε μελέτης EV η προσπάθεια να αποδειχθεί ότι μια λειτουργία είναι ειδική για τα εξωσώματα σε σύγκριση με άλλους τύπους μικρών EV, λόγω των προβλημάτων που σχετίζονται με τις μη τυποποιημένες προσεγγίσεις, την ανεπαρκή απομόνωση/διαχωρισμό των σωματιδίων για τον προσδιορισμό της λειτουργίας και τα μη επαληθεύσιμα αποτελέσματα.

Παρακάτω παρατίθενται τα κυριότερα σημεία από την επικαιροποίηση της MISEV 2018. Η ίδια η έκθεση είναι αρκετά μεγάλη, οπότε παρέθεσα τα πιο σημαντικά τμήματα:

–> Ελάχιστες πληροφορίες για μελέτες εξωκυτταρικών κυστιδίων 2018 (MISEV2018): δήλωση θέσης της Διεθνούς Εταιρείας Εξωκυτταρικών Κυστιδίων και επικαιροποίηση των κατευθυντήριων γραμμών MISEV2014

“Την τελευταία δεκαετία έχει αυξηθεί κατακόρυφα ο αριθμός των επιστημονικών δημοσιεύσεων που περιγράφουν τις φυσιολογικές και παθολογικές λειτουργίες των εξωκυτταρικών κυστιδίων (EVs), ενός συλλογικού όρου που καλύπτει διάφορους υποτύπους μεμβρανώδους δομών που απελευθερώνονται από τα κύτταρα και ονομάζονται εξωσώματα, μικροβυστίδια, μικροσωματίδια, εκτοσώματα, ογκοσώματα, αποπτωτικά σώματα και πολλές άλλες ονομασίες. Ωστόσο, προκύπτουν ειδικά ζητήματα κατά την εργασία με αυτές τις οντότητες, το μέγεθος και η ποσότητα των οποίων συχνά καθιστούν δύσκολη τη λήψη τους ως σχετικά καθαρά παρασκευάσματα και τον κατάλληλο χαρακτηρισμό τους. Η Διεθνής Εταιρεία Εξωκυτταρικών Σωληναρίων (ISEV) πρότεινε το 2014 τις κατευθυντήριες γραμμές Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles (“MISEV”) για τον τομέα. Τώρα επικαιροποιούμε αυτές τις κατευθυντήριες γραμμές “MISEV2014” με βάση την εξέλιξη της συλλογικής γνώσης τα τελευταία τέσσερα χρόνια. Ένα σημαντικό σημείο που πρέπει να ληφθεί υπόψη είναι ότι η απόδοση μιας συγκεκριμένης λειτουργίας στα EVs γενικά ή σε υποτύπους EVs απαιτεί την αναφορά συγκεκριμένων πληροφοριών πέραν της απλής περιγραφής της λειτουργίας σε ένα ακατέργαστο, δυνητικά μολυσμένο και ετερογενές παρασκεύασμα. Για παράδειγμα, οι ισχυρισμοί ότι τα εξωσώματα είναι προικισμένα με εξαιρετικές και ειδικές δραστηριότητες παραμένουν δύσκολο να υποστηριχθούν πειραματικά, δεδομένης της ακόμη περιορισμένης γνώσης μας για τους συγκεκριμένους μοριακούς μηχανισμούς βιογένεσης και απελευθέρωσής τους, σε σύγκριση με άλλα βιοφυσικά παρόμοια EVs. Οι κατευθυντήριες γραμμές MISEV2018 περιλαμβάνουν πίνακες και περιγράμματα προτεινόμενων πρωτοκόλλων και βημάτων που πρέπει να ακολουθηθούν για την τεκμηρίωση συγκεκριμένων λειτουργικών δραστηριοτήτων που σχετίζονται με τα EV. Τέλος, παρέχεται ένας κατάλογος ελέγχου με περιλήψεις των βασικών σημείων.

-#- Εισαγωγή

Το 2014, τα μέλη του διοικητικού συμβουλίου του ISEV δημοσίευσαν ένα Position Editorial, στο οποίο περιγράφονται λεπτομερώς οι συστάσεις τους, με βάση τη δική τους καθιερωμένη εμπειρογνωμοσύνη, σχετικά με τις “ελάχιστες πειραματικές απαιτήσεις για τον ορισμό των εξωκυτταρικών κυστιδίων και των λειτουργιών τους” [1]. Παρουσιάστηκε ένας κατάλογος ελάχιστων πληροφοριών για μελέτες εξωκυτταρικών κυστιδίων (MISEV ή MISEV2014), ο οποίος καλύπτει τον διαχωρισμό/απομόνωση, τον χαρακτηρισμό και τις λειτουργικές μελέτες εξωκυτταρικών κυστιδίων (EV). Ο κύριος στόχος αυτών των συστάσεων ήταν να ευαισθητοποιηθούν οι ερευνητές (ιδίως ο ταχέως αυξανόμενος αριθμός επιστημόνων που ενδιαφέρονται πρόσφατα για τα EV), καθώς και οι συντάκτες και οι κριτές των περιοδικών, όσον αφορά τις πειραματικές απαιτήσεις και τις απαιτήσεις υποβολής εκθέσεων που αφορούν ειδικά τον τομέα των EV. Το συμβούλιο του ISEV υπογράμμισε την ανάγκη να λαμβάνονται υπόψη αυτά τα ζητήματα όταν διατυπώνονται ισχυρά συμπεράσματα σχετικά με τη συμμετοχή των EVs ή συγκεκριμένων πληθυσμών EVs (ιδίως των εξωσωμάτων) σε οποιαδήποτε φυσιολογική ή παθολογική κατάσταση ή όταν προτείνονται τα EVs ή το μοριακό φορτίο τους ως βιολογικοί δείκτες. Διεγείροντας τη βελτίωση της αξιοπιστίας και της αναπαραγωγιμότητας των δημοσιευμένων αποτελεσμάτων των EV, οι συγγραφείς του MISEV2014 ήλπιζαν να προωθήσουν την υπόσχεση των EVs ως βιοδεικτών ή για θεραπευτικές εφαρμογές, ακόμη και μπροστά στον σκεπτικισμό ορισμένων επιστημόνων εκτός του πεδίου.

Όπως αποδεικνύεται από τον αυξανόμενο αριθμό δημοσιεύσεων EV σε περιοδικά υψηλού κύρους, που προτείνουν σημαντικό ρόλο των EVs σε πολυάριθμα φυσιολογικά μονοπάτια από τη γήρανση έως τον καρκίνο, τις μολυσματικές ασθένειες έως την παχυσαρκία, η επιστήμη των EVs έχει πλέον σαφώς επιτύχει ευρύ ενδιαφέρον και ενθουσιασμό πολύ πέρα από την ερευνητική κοινότητα των EV. Ωστόσο, η προώθηση της αυστηρής επιστήμης EV είναι μια συνεχής διαδικασία- ως ειδικοί EV στην κοινότητα ISEV, εξακολουθούμε να ανησυχούμε βλέποντας ότι τα σημαντικά συμπεράσματα σε ορισμένα άρθρα δεν υποστηρίζονται επαρκώς από τα πειράματα που έχουν διεξαχθεί ή τις πληροφορίες που αναφέρονται. Ως εκ τούτου, στοχεύουμε στην αναθεώρηση και ανανέωση των συστάσεων του MISEV και στη συνέχιση των εργασιών για την ευρύτερη αποδοχή και εφαρμογή τους. Σε αυτή την επικαιροποίηση “MISEV2018″, μια πολύ μεγαλύτερη ομάδα επιστημόνων του ISEV συμμετείχε μέσω μιας κοινοτικής προσέγγισης (η έρευνα MISEV2018), προσπαθώντας να επιτύχει συναίνεση σχετικά με το τι είναι απολύτως απαραίτητο, τι πρέπει να γίνει εάν είναι δυνατόν και πώς να ερμηνεύονται με προσοχή τα αποτελέσματα εάν δεν μπορούν να ακολουθηθούν όλες οι συστάσεις για τους ελέγχους.

Πιστεύουμε ακράδαντα ότι οι περισσότερες από τις συστάσεις του MISEV2014 εξακολουθούν να ισχύουν- ωστόσο, οι ανακαλύψεις και οι εξελίξεις στον τομέα κατά τη διάρκεια των τελευταίων τεσσάρων ετών επιβάλλουν ορισμένες τροποποιήσεις. Το παρόν έγγραφο εξηγεί πώς οι συστάσεις του 2014 εξελίχθηκαν σε MISEV2018 στους πίνακες 1, 2 και 4. Παρέχει προτάσεις για πρωτεϊνικούς δείκτες για την επικύρωση της παρουσίας EVs (πίνακας 3) και, για να επισημανθούν τα σημαντικότερα σημεία, παρέχει περιγράμματα παραδειγματικών προσεγγίσεων για την αντιμετώπιση ορισμένων από τα σημαντικότερα πειραματικά ζητήματα. Είναι σημαντικό ότι στο τέλος του παρόντος άρθρου παρέχεται ένας κατάλογος ελέγχου 2 σελίδων που συνοψίζει τις κύριες πτυχές που πρέπει να ακολουθούνται στην επιστήμη των EV.”

—> Σημείωση σχετικά με τη δυνατότητα εφαρμογής του MISEV2018: είδη, κύτταρα, τύποι δειγμάτων και πειραματικές συνθήκες

“Ισχύει η MISEV2018 για όλες τις μελέτες EV ή μόνο για ορισμένες; Τα EVs φαίνεται να παράγονται σχεδόν από όλους τους οργανισμούς και τους κυτταρικούς τύπους που μελετήθηκαν. Ωστόσο, η έρευνα για τα EV μέχρι σήμερα έχει επικεντρωθεί στα EVs θηλαστικών, κυρίως αυτά που προέρχονται από τον άνθρωπο ή τα ποντίκια, και δεν έχουν διερευνηθεί διεξοδικά όλοι οι τύποι κυττάρων ή οι πειραματικές συνθήκες. Στο παρόν έγγραφο, όπως και στο MISEV2014, συγκεκριμένα παραδείγματα μοριακών δεικτών (όπως οι δείκτες των EVs στον πίνακα 3) βασίζονται σε μελέτες συγκεκριμένων ειδών, κυττάρων και πειραματικών συνθηκών. Ορισμένοι μπορεί να είναι ευρέως εφαρμόσιμοι, άλλοι λιγότερο. Ωστόσο, οι γενικές αρχές του MISEV2018 ισχύουν για τα EVs που παράγονται από όλους τους οργανισμούς και όλα τα κύτταρα. Η ανάγκη απόδειξης της παρουσίας (ή του εμπλουτισμού) δεικτών EV και της απουσίας (ή της εξάντλησης) υποτιθέμενων προσμίξεων, όταν περιγράφεται το περιεχόμενο ή η λειτουργία των EVs, μπορεί να γενικευτεί για όλα τα είδη, τα κύτταρα και τις συνθήκες. Βρισκόμαστε σε ένα συναρπαστικό επιστημονικό πεδίο- όπου δεν υπάρχουν ακόμη τέτοιοι δείκτες, ενθαρρύνουμε την ανάπτυξη και τη δημοσίευσή τους, χρησιμοποιώντας τις αρχές του παρόντος εγγράφου ως οδηγό. Πρόσθετα συγκεκριμένα παραδείγματα μπορούν στη συνέχεια να ενσωματωθούν σε μελλοντικές επικαιροποιήσεις του MISEV.

-#- Ονοματολογία

Η ISEV υποστηρίζει το “εξωκυττάριο κυστίδιο” (EV) ως το γενικό όρο για τα σωματίδια που απελευθερώνονται φυσικά από το κύτταρο, τα οποία οριοθετούνται από μια λιπιδική διπλοστοιβάδα και δεν μπορούν να αναπαραχθούν, δηλαδή δεν περιέχουν λειτουργικό πυρήνα. Δεδομένου ότι δεν έχει ακόμη προκύψει συναίνεση σχετικά με ειδικούς δείκτες υποτύπων EV, όπως τα “εξωσώματα” ενδοσωματικής προέλευσης και τα “εκτοσώματα” (μικροσωματίδια/μικροκυψελίδες) που προέρχονται από την πλασματική μεμβράνη [3,4], η αντιστοίχιση ενός EV σε μια συγκεκριμένη οδό βιογένεσης παραμένει εξαιρετικά δύσκολη, εκτός εάν, π.χ., το EV συλλαμβάνεται εν τη γενέσει της απελευθέρωσης με τεχνικές ζωντανής απεικόνισης. Επομένως, εκτός εάν οι συγγραφείς μπορούν να καθιερώσουν συγκεκριμένους δείκτες υποκυτταρικής προέλευσης που είναι αξιόπιστοι εντός του(των) πειραματικού(-ών) τους συστήματος(-ων), οι συγγραφείς παροτρύνονται να εξετάσουν τη χρήση λειτουργικών όρων για τους υποτύπους EV που αναφέρονται α) στα φυσικά χαρακτηριστικά των EV, όπως το μέγεθος (“μικρά EVs” (sEVs) και “μεσαία/μεγάλα EVs” (m/lEVs), με καθορισμένα εύρη, για παράδειγμα, αντίστοιχα, < 100nm ή < 200nm [μικρά], ή > 200nm [μεγάλα ή/και μεσαία]) ή την πυκνότητα (χαμηλή, μεσαία, υψηλή, με καθορισμένο κάθε εύρος), β) βιοχημική σύνθεση (CD63+/CD81+-EVs, EVs με χρώση Annexin A5, κ.λπ. ), ή γ) περιγραφές συνθηκών ή κυττάρων προέλευσης (EVs ποδοκυττάρων, υποξικά EVs, μεγάλα ογκοσωμάτια, αποπτωτικά σώματα) στη θέση όρων όπως εξώσωμα και μικροσωματίδιο, οι οποίοι ιστορικά επιβαρύνονται τόσο από πολλαπλούς, αντιφατικούς ορισμούς όσο και από ανακριβείς προσδοκίες μοναδικής βιογένεσης. Εάν κρίνεται αναπόφευκτη η χρήση αυτών ή νεοπαγών όρων, θα πρέπει να ορίζονται σαφώς και εμφανώς στην αρχή κάθε δημοσίευσης [5]. Εάν η επιβεβαίωση της ταυτότητας των EV δεν μπορεί να επιτευχθεί σύμφωνα με τις ελάχιστες απαιτήσεις της παρούσας δημοσίευσης MISEV2018, άλλοι όροι, όπως εξωκυτταρικό σωματίδιο (EP), μπορεί να είναι καταλληλότεροι.

–> Συλλογή και προεπεξεργασία: προ-αναλυτικές μεταβλητές

Το πρώτο βήμα για την ανάκτηση των EV είναι η συλλογή μιας μήτρας που περιέχει EV, όπως υγρό από καλλιέργεια ιστού ή από ένα διαμέρισμα οργανισμού. Κατά τη διάρκεια αυτής της προ-αναλυτικής φάσης, ένας εκτεταμένος αστερισμός παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των χαρακτηριστικών της πηγής, του τρόπου χειρισμού και αποθήκευσης του αρχικού υλικού και των πειραματικών συνθηκών, μπορεί να επηρεάσει την ανάκτηση EV. Ως εκ τούτου, είναι ζωτικής σημασίας ο σχεδιασμός των διαδικασιών συλλογής και πειραματισμού ώστε να μεγιστοποιείται ο αριθμός των γνωστών, αναφερόμενων παραμέτρων και, στη συνέχεια, η αναφορά όσων προαναλυτικών παραμέτρων είναι γνωστές.

-#- Εξαρτημένα μέσα κυτταροκαλλιέργειας

Για την απομόνωση/χαρακτηρισμό EV από κλιματιζόμενα μέσα (μια έρευνα ISEV διαπίστωσε ότι η πλειονότητα των ερευνητών EV που απάντησαν μελετούσαν κλιματιζόμενα μέσα [6]), πρέπει να πραγματοποιείται και να αναφέρεται ο βασικός χαρακτηρισμός των κυττάρων που απελευθερώνουν και των συνθηκών καλλιέργειας και συλλογής. Ορισμένες προφυλάξεις, όπως η τακτική επιβεβαίωση της κυτταρικής ταυτότητας (π.χ. με προφίλ βραχέων επαναλήψεων τανδήματος (STR) ή άλλες μεθόδους) [7,8] και η ταυτοποίηση της κυτταρικής σειράς και προέλευσης, συμπεριλαμβανομένου του τρόπου αθανασίας [9], συνιστώνται για όλες τις μελέτες κυττάρων. Ιδιαίτερα σημαντικό για τις μελέτες EV είναι να αναφέρεται το ποσοστό των νεκρών κυττάρων κατά τη στιγμή της συγκομιδής των EV, δεδομένου ότι ακόμη και ένα μικρό ποσοστό κυτταρικού θανάτου θα μπορούσε να απελευθερώσει κυτταρικές μεμβράνες που ξεπερνούν σε αριθμό τα πραγματικά απελευθερωμένα EV. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του ποσοστού των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων μπορεί επίσης να είναι χρήσιμος. (Σημειώστε, ωστόσο, ότι όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με υψηλές συγκεντρώσεις EVs, τα προσκολλημένα στα κύτταρα EVs που είναι θετικά για αποπτωτικούς δείκτες ενδέχεται να αλλοιώσουν τα αποτελέσματα [10,11]). Άλλα σχετικά χαρακτηριστικά των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της κατάστασης ενεργοποίησης, της κακοήθειας και της γήρανσης [12,13], θα πρέπει να αναφέρονται κατά περίπτωση.

Συνθήκες καλλιέργειας και συγκομιδής, όπως αριθμός διέλευσης (ή ημέρες σε καλλιέργεια για κύτταρα εναιώρημα), πυκνότητα σποράς [14], πυκνότητα/συγκέντρωση κατά τη συγκομιδή [14], συμπεριλαμβανομένων τυχόν σχετικών χαρακτηριστικών μετά τη συγκομιδή, όπως η ανάπτυξη πολικότητας [15-19] (στην περίπτωση αυτή, συλλέχθηκαν τα EV συνολικά ή χωριστά, από τα διάφορα μέρη των πολωμένων κυττάρων;), όγκος καλλιέργειας, δοχείο καλλιέργειας ή σύστημα βιοαντιδραστήρα (εάν χρησιμοποιήθηκαν [20,21]), επιφανειακές επιστρώσεις, τάσεις οξυγόνου ή άλλων αερίων (εάν διαφέρουν από την τυπική κυτταροκαλλιέργεια) [22,23], διέγερση και άλλες θεραπείες [24-30], καθώς και συχνότητα και διαστήματα συγκομιδής [14] θα πρέπει να δίνονται ώστε να είναι δυνατή η αναπαραγωγή [31,32]. Θα πρέπει επίσης να δίνονται οι συνθήκες καλλιέργειας πριν από τη θεραπεία (ή τις θεραπείες), εάν υπάρχουν. Σημειώστε ότι η ανάκτηση EV δεν εξαρτάται μόνο από την απελευθέρωση EV, αλλά και από την επαναπρόσληψη από τα κύτταρα στην καλλιέργεια, η οποία μπορεί να ποικίλλει με βάση την πυκνότητα καλλιέργειας και άλλες συνθήκες. Απαιτούνται τακτικοί έλεγχοι για επιμόλυνση με μυκόπλασμα (και πιθανώς άλλα μικρόβια), όχι μόνο λόγω των κυτταρικών αντιδράσεων στη μόλυνση, αλλά και επειδή τα μολυσματικά είδη μπορούν να απελευθερώσουν EV [33-36]. Θα πρέπει επίσης να δίνονται ακριβείς μέθοδοι συλλογής του μέσου (π.χ. μετάγγιση ή σιφώνιο από φιάλες, φυγοκέντρηση κυτταρικών καλλιεργειών εναιωρήματος). Οι προτεινόμενες παράμετροι δεν είναι φυσικά περιεκτικές και ενδέχεται να είναι απαραίτητο να αναφερθούν και άλλες για συγκεκριμένους τύπους κυττάρων και πειραμάτων, συμπεριλαμβανομένων των συστημάτων συγκαλλιέργειας και των οργανοειδών καλλιεργειών [37].

Όλες οι λεπτομέρειες σχετικά με τη σύνθεση και την προετοιμασία του μέσου καλλιέργειας θα πρέπει να παρέχονται στις μεθόδους. Αυτό θα πρέπει να συνηθίζεται για μελέτες κυτταροκαλλιέργειας και είναι διπλά σημαντικό εδώ, δεδομένου ότι συμπληρώματα όπως η γλυκόζη [38-40], τα αντιβιοτικά [41] και οι αυξητικοί παράγοντες [42] μπορούν να επηρεάσουν την παραγωγή ή/και τη σύνθεση των EV. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στα συστατικά του μέσου που είναι πιθανό να περιέχουν EVs, όπως ο ορός. Τα EVs λαμβάνονται ιδανικά από μέσο καλλιέργειας που κλιματίζεται από κύτταρα απουσία εμβρυϊκού ορού μοσχαριού (FCS ή FBS), ορού από άλλα είδη ή άλλων σύνθετων προϊόντων, όπως το λυσάρι αιμοπεταλίων, το εκχύλισμα υπόφυσης, τα χολικά άλατα και άλλα, ώστε να αποφεύγεται η συναπομόνωση εξωγενών EVs. Όταν η χρήση αυτών των συμπληρωμάτων είναι αναπόφευκτη, τα πειράματα θα πρέπει να περιλαμβάνουν έναν έλεγχο μη κλιματιζόμενου μέσου για την αξιολόγηση της συμβολής του ίδιου του μέσου. Ωστόσο, ανάλογα με τη μεταγενέστερη χρήση, ενδέχεται να μην είναι απαραίτητη ή επιθυμητή η απομάκρυνση των EVs [43,44]. Στην περίπτωση της εξάντλησης, δεδομένου ότι η στέρηση θρεπτικών συστατικών ή EVs από κύτταρα που κανονικά καλλιεργούνται σε μέσο που περιέχει ορό ή λυσάτη μπορεί να αλλάξει την κυτταρική συμπεριφορά και τη φύση και τη σύνθεση των απελευθερούμενων EVs [45,46], είναι σημαντικό να διευκρινιστεί το ιστορικό της καλλιέργειας (πώς και πότε έγινε η μετάβαση σε μέσο χωρίς ορό, συμπεριλαμβανομένων των βημάτων εγκλιματισμού). Εναλλακτικά, τα κύτταρα μπορούν να εκτεθούν κατά τη διάρκεια της περιόδου απελευθέρωσης EV σε μέσο που έχει προηγουμένως αφαιρεθεί από EVs. Και εδώ μπορεί να αναμένονται επιδράσεις στα κύτταρα και τα EVs [47], ενώ οι μέθοδοι και το αποτέλεσμα της απομάκρυνσης ποικίλλουν σε μεγάλο βαθμό και θα πρέπει να αναφέρονται. Διατίθενται αρκετά αποτελεσματικά πρωτόκολλα, όπως η υπερφυγοκέντρηση πλήρους μέσου (ή ορού μετά από αραίωση τουλάχιστον 1:4) με 100.000 x g για τουλάχιστον 18 ώρες [48], η φυγοκέντρηση σε αυξημένες ταχύτητες (π.χ. 200.000 x g [49]) για μικρότερα χρονικά διαστήματα ή η διήθηση εφαπτομενικής ροής ή άλλες μορφές υπερδιήθησης [50]. Η υπερφυγοκέντρηση σε περίπου 100k x g για λίγες ώρες ή χωρίς αραίωση δεν θα εξαλείψει όλα τα EV ή το RNA που σχετίζεται με τα EV [51-53]. Ο εμπορικός ορός “απαλλαγμένος από εξωσώματα/EV” και άλλα συμπληρώματα διατίθενται από όλο και περισσότερους προμηθευτές. Δεδομένου ότι η μέθοδος απομάκρυνσης δεν αναφέρεται συνήθως, οι συνέπειες στην κυτταρική ανάπτυξη και την απελευθέρωση EV μπορεί να μην είναι προβλέψιμες- θα πρέπει να δίνεται η ακριβής πηγή, η μέθοδος και η αναφορά των συμπληρωμάτων απομάκρυνσης και να ελέγχεται προσεκτικά ο “απαλλαγμένος από εξώσωμα” χαρακτήρας του προϊόντος πριν από τη χρήση [54]. Επιπλέον, οι πωλητές ενθαρρύνονται να αναφέρουν και να συγκρίνουν τις μεθόδους εξάντλησης που χρησιμοποιούνται στα προϊόντα τους, ενώ οι χρήστες θα πρέπει να αναφέρουν τους αριθμούς προϊόντων και παρτίδων, καθώς και οποιαδήποτε συγκέντρωση βιολογικών προϊόντων. Τέλος, θα πρέπει να αναφέρονται λεπτομέρειες σχετικά με την προετοιμασία του μέσου, συμπεριλαμβανομένων των βημάτων θέρμανσης (αδρανοποίηση με θερμότητα) ή διήθησης. Για παράδειγμα, η θερμική αδρανοποίηση πρόσθετων ουσιών, όπως ο ορός, οδηγεί σε σχηματισμό συσσωματωμάτων πρωτεϊνών που μπορεί να συν-κατακρημνιστούν με τα EVs και έτσι να αλλάξουν επίσης τις ιδιότητες του ορού που υποστηρίζουν την ανάπτυξη.

-#- Βιολογικά υγρά

Δεδομένου ότι υπάρχουν περισσότεροι από 30 τύποι βιορευστών στα θηλαστικά και ότι οι πλύσεις πολλών διαμερισμάτων προστίθενται σε αυτόν τον αριθμό (παρά το γεγονός ότι δεν είναι πραγματικά βιορευστά), το MISEV2018 δεν παρέχει μια εξαντλητική ανασκόπηση της βιβλιογραφίας σχετικά με τις προ-αναλυτικές μεταβλητές που σχετίζονται με όλα τα βιορευστά. Κάθε βιολογικό υγρό παρουσιάζει συγκεκριμένα βιοφυσικά και χημικά χαρακτηριστικά που το καθιστούν διαφορετικό από το μέσο προετοιμασίας καλλιέργειας, και αυτό πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά την απομόνωση των EVs. Για παράδειγμα, το πλάσμα και ο ορός είναι πιο παχύρρευστα από το κλιματιζόμενο μέσο. Το πλάσμα και ο ορός περιέχουν πολυάριθμες λιπιδικές δομές που δεν είναι EVs (λιποπρωτεΐνες χαμηλής/πολύ χαμηλής/υψηλής πυκνότητας), το γάλα είναι γεμάτο με κυστίδια που περιέχουν λίπος, τα ούρα με ουρομοντουλίνη (πρωτεΐνη Tamm-Horsfall), το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα με επιφανειοδραστική ουσία, τα οποία όλα θα συν-απομονωθούν σε διάφορους βαθμούς με EVs. Σε κάθε περίπτωση, ενδέχεται να απαιτούνται ειδικές προφυλάξεις για τον διαχωρισμό των EVs από αυτά τα συστατικά. Αν και οι λεπτομερείς κατευθυντήριες γραμμές για την αναφορά συγκεκριμένων βιορευστών ξεφεύγουν από το πεδίο εφαρμογής του παρόντος MISEV, ενθαρρύνουμε την ανάπτυξη τέτοιων κατευθυντήριων γραμμών υπό την ομπρέλα του MISEV.

Για την απομόνωση/χαρακτηρισμό των EV από βιορευστά όπως το πλάσμα αίματος, πολλά προηγούμενα έγγραφα θέσεων της ISEV [55,56] και άλλες δημοσιεύσεις (για μερικά μόνο από τα πολλά παραδείγματα, βλέπε [57-63]) έχουν απαριθμήσει απαιτήσεις αναφοράς που είναι σημαντικές για την τυποποίηση, και αυτές εξακολουθούν να ισχύουν σήμερα, ακόμη και αν εξακολουθούν να υπάρχουν πολλά ερωτήματα σχετικά με τις επιδράσεις συγκεκριμένων προ-αναλυτικών μεταβλητών στις διάφορες κατηγορίες EV. Δεδομένου ότι πολλοί από αυτούς τους παράγοντες έχουν καλυφθεί σε αυτές τις προηγούμενες δημοσιεύσεις, δεν τους επανεξετάζουμε εξαντλητικά εδώ. Για να δώσουμε παραδείγματα εκτιμήσεων για παράγωγα αίματος όπως το πλάσμα: η ηλικία του δότη, το βιολογικό φύλο, η τρέχουσα ή προηγούμενη εγκυμοσύνη, η εμμηνόπαυση, η προ/μεταγευματική κατάσταση (νηστεία/μη νηστεία), η ώρα της ημέρας συλλογής (κιρκαδιανές διακυμάνσεις), το επίπεδο άσκησης και ο χρόνος της τελευταίας άσκησης, η διατροφή, ο δείκτης μάζας σώματος, συγκεκριμένες λοιμώδεις και μη λοιμώδεις νόσοι, φάρμακα και άλλοι παράγοντες ενδέχεται να επηρεάσουν τα κυκλοφορούντα EVs [64,65]. Ομοίως, θα πρέπει να αναφέρονται σαφώς τεχνικοί παράγοντες, όπως ο όγκος συλλογής υγρών, η απόρριψη του πρώτου σωλήνα, ο τύπος του(των) δοχείου(ων), ο χρόνος επεξεργασίας, η επιλογή αντιπηκτικού (για πλάσμα αίματος) [66-68], η ανάμιξη ή η ανάδευση, η θερμοκρασία (αποθήκευσης και επεξεργασίας), η περιγραφή της μεταφοράς (εάν υπάρχει), εάν ο σωλήνας παρέμεινε όρθιος πριν από την επεξεργασία, οι ακριβείς διαδικασίες φυγοκέντρησης ή διήθησης, ο βαθμός αιμόλυσης, η πιθανή επιβεβαίωση της εξάντλησης αιμοπεταλίων και λιποπρωτεϊνών πριν από την αποθήκευση [69-73] και άλλες παράμετροι. Συνολικά, εκτός από ορισμένες που αφορούν ειδικά το πλάσμα/ορό (όπως η απομάκρυνση αιμοπεταλίων και η πήξη), οι προαναφερθείσες τεχνικές λεπτομέρειες των συνθηκών συλλογής ισχύουν για όλα τα βιοϋγρά και πρέπει να αναφέρονται. Φυσικά, μπορεί να μην έχουν καταγραφεί όλες οι μεταβλητές για τα αρχειοθετημένα δείγματα, και αυτό θα πρέπει να αναγνωρίζεται κατά περίπτωση.

-#- Ιστός

Ως ειδική περίπτωση προ-αναλυτικών ζητημάτων, ένας ταχέως αυξανόμενος αριθμός ομάδων έχει αναφέρει την απομόνωση EVs ιστών. Οι μελέτες αυτές μπορεί να περιλαμβάνουν βραχυπρόθεσμη καλλιέργεια ιστοτεμαχίων [74], όπως ex vivo όγκοι [75] ή πλακούντας [76,77], ή εξαγωγή από ολόκληρους ιστούς [78-84]. Πολλές από τις ίδιες εκτιμήσεις που ισχύουν για τις μελέτες κυτταρικών και βιορευστών ισχύουν και εδώ, συμπεριλαμβανομένης της επιβεβαίωσης της προέλευσης και της κατάστασης. Ειδικά για την εκχύλιση EV από ιστούς, είναι δύσκολο να διασφαλιστεί ότι τα ανακτώμενα κυστίδια προέρχονται πραγματικά από τον εξωκυττάριο χώρο και δεν είναι ενδοκυττάρια κυστίδια ή τεχνητά σωματίδια που απελευθερώνονται από κύτταρα που έχουν σπάσει κατά τη διάρκεια της συγκομιδής, της επεξεργασίας (π.χ. μηχανική διάσπαση) ή της αποθήκευσης (συμπεριλαμβανομένης της κατάψυξης). Αυτό μπορεί να είναι ιδιαίτερα δύσκολο σε έναν ιστό όπως ο εγκέφαλος, όπου χρησιμοποιούνται παρόμοιες διαδικασίες για τη συλλογή συναπτοσωμάτων [85]. Ακόμη και τα φαινομενικά καθαρά EVs που προέρχονται από ιστούς μπορεί να περιέχουν συστατικά ενδοσωμάτων, τα οποία θα μπορούσαν να αντιστοιχούν σε συστατικά ενδοκυτταρικών κυστιδίων, συμπεριλαμβανομένων των μη απελευθερωμένων ενδοσωματικών κυστιδίων των όψιμων ενδοσωμάτων/πολυκυτταρικών σωμάτων (MVBs) που απελευθερώνονται τεχνητά κατά την επεξεργασία των ιστών. Η πρόσφατη συνειδητοποίηση αυτών των προκλήσεων οδήγησε τους ερευνητές να πραγματοποιούν ήπια διάσπαση ιστών (δηλαδή με στόχο τον διαχωρισμό των EVs από τα κύτταρα και την εξωκυττάρια μήτρα, αλλά χωρίς να διαταράξουν τα κύτταρα) και διάφορα στάδια περαιτέρω διαχωρισμού (συμπεριλαμβανομένων των βαθμίδων πυκνότητας), ακολουθούμενα από αυστηρό χαρακτηρισμό πολλαπλών αρνητικών δεικτών, οδηγώντας σε πιο πειστικά παρασκευάσματα EV προερχόμενα από ιστούς [79]. Η χρήση γενετικά τροποποιημένων μοντέλων για τον εντοπισμό της απελευθέρωσης EV από συγκεκριμένα κύτταρα [83] αποτελεί επίσης χρήσιμη προσέγγιση. Σαφώς απαιτείται και ενθαρρύνεται περισσότερη έρευνα σχετικά με την απομόνωση, τον χαρακτηρισμό και τη λειτουργία των ιστικών EVs, σε σύγκριση με τα ενδοκυτταρικά κυστίδια ή/και τα μη κυψελιδικά εξωκυτταρικά σωματίδια (EPs).

-#- Διαχωρισμός και συγκέντρωση EV: πώς εξελίσσεται το MISEV2014 το 2018

Ο απόλυτος καθαρισμός ή η πλήρης απομόνωση των EV από άλλες οντότητες είναι ένας μη ρεαλιστικός στόχος (όπως και για πολλά βιολογικά προϊόντα). Για τον λόγο αυτό, και δεδομένου ότι οι διάφοροι συνδυασμοί EVs και μέσων είναι κολλοειδή [98], εδώ χρησιμοποιούμε τους όρους διαχωρισμός και συγκέντρωση. Ο διαχωρισμός (που στην καθομιλουμένη αναφέρεται ως καθαρισμός ή απομόνωση) 1) των EVs από άλλα μη EV συστατικά της μήτρας (κλιματιζόμενο μέσο, βιορευστό, ιστός) και 2) των διαφόρων τύπων EVs μεταξύ τους, επιτυγχάνεται σε διάφορους βαθμούς με τις διάφορες διαθέσιμες τεχνικές. Η συγκέντρωση είναι ένα μέσο για την αύξηση του αριθμού των EVs ανά μονάδα όγκου, με ή χωρίς διαχωρισμό. Ο όρος “εμπλουτισμός” μπορεί να αναφέρεται στην αύξηση της συγκέντρωσης, δηλαδή του αριθμού των EV σε σχέση με τον όγκο, ή στην αύξηση του αριθμού των EV/δεικτών σε σχέση με ένα άλλο συστατικό. Η έκταση του διαχωρισμού ή της συγκέντρωσης μπορεί να εκτιμηθεί με τον χαρακτηρισμό, ο οποίος θα αναλυθεί στην επόμενη ενότητα.

Πόσο καθαρό πρέπει να είναι ένα παρασκεύασμα EV; Η απάντηση εξαρτάται από το πειραματικό ερώτημα και την τελική χρήση των EV και συχνά διαχωρίζεται κατά βασική και κλινική έρευνα. Υψηλά καθαρισμένα EV απαιτούνται για να αποδοθεί μια λειτουργία ή ένας βιοδείκτης στα κυστίδια σε σύγκριση με άλλα σωματίδια. Λιγότερο καθαρά EVs μπορεί να απαιτούνται σε άλλες περιπτώσεις, όπως όταν ένας βιοδείκτης είναι χρήσιμος χωρίς προ-εμπλουτισμό των EVs, ή σε ορισμένες θεραπευτικές καταστάσεις όπου προέχει η λειτουργία και όχι η οριστική συσχέτιση της λειτουργίας με τα EVs. Σημειωτέον, ορισμένοι υποτιθέμενοι μολυσματικοί παράγοντες μπορεί να συν-απομονώνονται με τα EVs και να συμβάλλουν ακόμη και στη λειτουργία των EVs. Ως εκ τούτου, η επιλογή της μεθόδου διαχωρισμού και συγκέντρωσης πρέπει να βασίζεται σε παράγοντες που μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των μελετών, έτσι ώστε να μην υπάρχει μια προσέγγιση που να ταιριάζει σε όλους. Περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με το θέμα αυτό (λειτουργία και παράγοντες συν-απομόνωσης) δίνονται στην ενότητα 5γ-δ (σελ. 24).

Στα τέλη του 2015, σύμφωνα με παγκόσμια έρευνα του ISEV [6], η διαφορική υπερφυγοκέντρηση ήταν η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική πρωτογενούς διαχωρισμού και συγκέντρωσης EV, ενώ διάφορες άλλες τεχνικές, όπως οι βαθμίδες πυκνότητας, η καταβύθιση, η διήθηση, η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους και η ανοσοαπομόνωση, χρησιμοποιούνταν από 5-20% των ερωτηθέντων η καθεμία. Η σχετική επιτυχία αυτών των διαφορετικών μεθόδων όσον αφορά την ανάκτηση και την ειδικότητα των EV (σε σύγκριση με τα μη κυψελιδικά συστατικά) ή τους υποτύπους των EV, έχει εξεταστεί σε προηγούμενο ISEV

Position Paper (βλ. Εικόνα 1 του [56]), και συνοψίζεται στον Πίνακα 1 κατωτέρω. Για την επίτευξη καλύτερης εξειδίκευσης του διαχωρισμού EV ή υποτύπων EV, οι περισσότεροι ερευνητές χρησιμοποιούν μία ή περισσότερες πρόσθετες τεχνικές μετά το πρωταρχικό βήμα, όπως πλύση σε ρυθμιστικό διάλυμα χωρίς EV, υπερδιήθηση, εφαρμογή βαθμίδων πυκνότητας (ταχύτητας ή επίπλευσης) ή χρωματογραφία [6,99-102].

Έχουν αναπτυχθεί ή αναπτύσσονται επί του παρόντος διάφορες πρόσθετες τεχνικές ή συνδυασμοί τεχνικών, ορισμένες από τις οποίες ενδέχεται να αποκτήσουν μεγαλύτερη σημασία τα επόμενα χρόνια, εάν επιτύχουν καλύτερη ανάκτηση ή ειδικότητα από τις παλαιότερες μεθόδους (και αυτό πρέπει να αποδειχθεί, όπως π.χ. στο [103]). Τέτοιες μέθοδοι είναι η διήθηση εφαπτομενικής ροής και οι παραλλαγές της [21,104-110], η κλασματοποίηση ροής πεδίου (FFF) [111], η κλασματοποίηση ροής πεδίου ασύμμετρης ροής (AFFF, A4F ή AF4) [112-114], η ιξωδοελαστική ροή χωρίς πεδίο [115], ηλεκτροφορητική εναλλασσόμενου ρεύματος [116,117], ακουστική [118], παραλλαγές της χρωματογραφίας αποκλεισμού μεγέθους (SEC) [100,119-121], χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων [122-124], μικροδιήθηση [125], διαλογή με ενεργοποίηση φθορισμού [126, 127] (ιδίως για μεγαλύτερα EVs, συμπεριλαμβανομένων των μεγάλων αποπτωτικών σωμάτων [128] και των μεγάλων ογκοσωμάτων [129]), πίνακες ντετερμινιστικής πλευρικής μετατόπισης (DLD) [130], νέα ανοσοαπομόνωση ή άλλες τεχνολογίες απομόνωσης συγγένειας [131-138], συμπεριλαμβανομένης της συγγένειας λιπιδίων [139], νέες τεχνικές καταβύθισης/συνδυασμού [140-142], διάλυση με υδροστατική διήθηση [143], μέθοδοι υψηλής απόδοσης/υψηλής πίεσης, όπως η γρήγορη πρωτεϊνική/υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (FPLC/ HPLC) που περιλαμβάνουν κάποια μορφή χρωματογραφίας

[144] και μια ευρεία ποικιλία συσκευών μικρορευστομηχανικής που

αξιοποιούν μία ή περισσότερες αρχές, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων από αυτές που αναφέρονται ανωτέρω [145-153]. Φυσικά, οι συνδυασμοί μεθόδων θα συνεχίσουν να χρησιμοποιούνται και ενδέχεται να υπερτερούν των προσεγγίσεων με μία μέθοδο.

Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τις οδηγίες που δόθηκαν στο MISEV2014 για την απομόνωση EV (αριστερή στήλη) και τις επικαιροποιήσεις τους στο MISEV2018 (δεξιά).

-#- Χαρακτηρισμός EV: πώς εξελίσσεται το MISEV2014 το 2018

Ο χαρακτηρισμός των EVs με πολλαπλές, συμπληρωματικές τεχνικές είναι σημαντικός για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των μεθόδων διαχωρισμού και για την εξακρίβωση της πιθανότητας ότι οι βιοδείκτες ή οι λειτουργίες σχετίζονται με τα EVs και όχι με άλλα συν-απομονωμένα υλικά. Η ανάγκη κατευθυντήριων γραμμών για τον χαρακτηρισμό υπογραμμίστηκε από μια μελέτη κοινοπραξίας υπό την καθοδήγηση του Hendrix και των συνεργατών του [161]. Οι εν λόγω συγγραφείς διαπίστωσαν ότι μόνο τα μισά περίπου άρθρα σχετικά με τα EV που δημοσιεύθηκαν εντός μιας πενταετούς περιόδου περιλάμβαναν θετικούς δείκτες των EV και μόνο μια μικρή μειοψηφία συμπλήρωνε τους θετικούς με αρνητικούς δείκτες για την ανίχνευση συν-απομονωμένων συστατικών εκτός των EV. Η ISEV συνιστά κάθε παρασκεύασμα EVs να 1) ορίζεται με ποσοτικά μέτρα της πηγής των EVs (π.χ. αριθμός των κυττάρων που εκκρίνουν, όγκος βιορευστού, μάζα ιστού)- 2) χαρακτηρίζεται στο μέτρο του δυνατού για τον προσδιορισμό της αφθονίας των EVs (συνολικός αριθμός σωματιδίων ή/και περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες ή λιπίδια)- 3) ελέγχεται για την παρουσία συστατικών που σχετίζονται με υποτύπους EVs ή EVs γενικά, ανάλογα με την ειδικότητα που επιθυμεί κανείς να επιτύχει- και 4) ελέγχεται για την παρουσία μη κυψελιδικών, συν-απομονωμένων συστατικών.

Ο πίνακας 2 συνοψίζει τις οδηγίες που δόθηκαν στο MISEV2014 για τον χαρακτηρισμό των EV και τις επικαιροποιήσεις τους στο MISEV2018. Αυτές οι συστάσεις ισχύουν για τα EV από όλες τις πηγές, συμπεριλαμβανομένων μη θηλαστικών και μη ευκαρυωτικών κυττάρων και οργανισμών.

-#- Ποσοτικός προσδιορισμός των EVs

Δεδομένου ότι ο ποσοτικός προσδιορισμός των ίδιων των EVs παραμένει δύσκολος (βλ. κατωτέρω), ως ελάχιστη πληροφορία, θα πρέπει να αναφέρεται για κάθε πειραματική χρήση ο συνολικός αρχικός όγκος βιορευστού ή, για το κλιμακωμένο μέσο, ο αριθμός των κυττάρων ή η μάζα του ιστού κατά τη στιγμή της συλλογής. Εάν το τελευταίο δεν είναι δυνατό, για παράδειγμα λόγω των συνθηκών καλλιέργειας (όπως η περιοδική συλλογή σε καλλιέργειες που βασίζονται σε συνεχείς βιοαντιδραστήρες [162]), πρέπει να αναφέρεται ο αριθμός των κυττάρων κατά την έναρξη της καλλιέργειας, ο αναμενόμενος χρόνος διπλασιασμού και η συχνότητα συλλογής. Για ορισμένα βιολογικά υγρά, όπως τα ούρα, ο όγκος εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις προ-αναλυτικές συνθήκες (ιδίως την πρόσληψη υγρών από τον δότη), επομένως θα πρέπει να εξεταστούν πρόσθετα μέσα κανονικοποίησης, όπως η κρεατινίνη ούρων, όπως γίνεται συνήθως στην κλινική για τη λευκωματίνη [163].

Τα EV έχουν σωματιδιακή δομή και περιέχουν πρωτεΐνες, λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα και άλλα βιομόρια. Η ποσοτικοποίηση καθενός από αυτά τα συστατικά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατο για την ποσοτικοποίηση των EVs, αλλά καμία από αυτές τις τιμές δεν συσχετίζεται απαραίτητα απόλυτα με τον αριθμό των EVs.

Ο αριθμός των σωματιδίων μπορεί να μετρηθεί με τεχνολογίες σκέδασης φωτός, όπως η ανάλυση παρακολούθησης νανοσωματιδίων (NTA)- με τυπική κυτταρομετρία ροής για μεγαλύτερα EV [164-167] ή κυτταρομετρία ροής υψηλής ανάλυσης για μικρότερα EV [127,168-176]- με παλμική ανίχνευση αντίστασης (RPS) για ένα ευρύ φάσμα μεγεθών, ανάλογα με το μέγεθος των πόρων [177]- με κρυο-EM [174]- με μια πλατφόρμα που συνδυάζει τον επιφανειακό πλασμονικό συντονισμό (SPR) με AFM [178]- ή με άλλες τεχνικές με παρόμοιες δυνατότητες. Η ακριβής ποσοτικοποίηση μπορεί να είναι δυνατή μόνο εντός ενός συγκεκριμένου εύρους συγκέντρωσης και μεγέθους που ποικίλλει ανάλογα με την πλατφόρμα- όπου είναι δυνατόν, το εύρος αυτό (ή η ελάχιστη και η μέγιστη διάμετρος που μετρήθηκε) πρέπει να αναφέρεται μαζί με τη συγκέντρωση. Θα πρέπει να αναφέρεται η μέθοδος προσδιορισμού του όγκου στην κυτταρομετρία ροής και να ελέγχονται τα πιθανά τεχνουργήματα σμήνους/συνύπαρξης [179]- ένα λεπτομερέστερο άρθρο-οδηγός σχετικά με τις ιδιαιτερότητες της ανάλυσης των EVs με κυτταρομετρία ροής βρίσκεται υπό προετοιμασία από μέλη των ISEV, ISCT και ISAC. Ορισμένες συσκευές για σωματίδια ποσοτικοποίησης έχουν το πλεονέκτημα να παρέχουν ακριβείς πληροφορίες για το μέγεθος ενός πολύπλοκου μείγματος σωματιδίων (βλ. Πίνακα 2γ: ανάλυση μεμονωμένων κυστιδίων). Αυτό δεν ισχύει για τη δυναμική σκέδαση φωτός (DLS), η οποία είναι ακριβής μόνο για μονοδιάσπαρτους πληθυσμούς σωματιδίων [180]. Η καταμέτρηση σωματιδίων με φωτεινή σκέδαση, RPS και παρόμοιες τεχνικές οδηγεί συνήθως σε υπερεκτίμηση του αριθμού των EV, δεδομένου ότι οι τεχνικές δεν είναι ειδικές για τα EV και καταγράφουν επίσης συν-ομοιογενή σωματίδια, συμπεριλαμβανομένων των λιποπρωτεϊνών και των συσσωματωμάτων πρωτεϊνών. Ενδεχομένως, η συνεχιζόμενη ανάπτυξη των δυνατοτήτων φθορισμού των συσκευών NTA μπορεί τελικά να επιτρέψει τη μέτρηση ειδικά για τα EV [181], αν και η ευαισθησία των δοκιμών και η τάση των αντισωμάτων σήμανσης και των λιπιδικών χρωστικών να σχηματίζουν σωματίδια θέτουν σημαντικά εμπόδια σε τέτοιες εφαρμογές [127,182]. Επιπλέον, οι τεχνολογίες καταμέτρησης σωματιδίων μπορεί να είναι προκατειλημμένες προς ορισμένες περιοχές μεγέθους σωματιδίων (ιδίως 50-150 nm [183,184]) λόγω του μεγέθους των πόρων (RPS), του μεγέθους του χρησιμοποιούμενου βαθμονομητή, της ευαισθησίας (για παράδειγμα, τα μικρότερα σωματίδια σκεδάζουν λιγότερο το φως) και της ικανότητας αντιμετώπισης της πολυδιασποράς (DLS έναντι NTA) [185]. Τέλος, το ιδιόκτητο λογισμικό που χρησιμοποιείται για την ανάλυση των δεδομένων από κάθε συσκευή μπορεί να εφαρμόζει άγνωστη επιλογή και άλλη επεξεργασία των δεδομένων, με αποτέλεσμα να υπάρχουν διαφορές στις απόλυτες τιμές που λαμβάνονται από διαφορετικά λογισμικά ή διαφορετικές εκδόσεις του ίδιου λογισμικού (βλέπε παράδειγμα στο [183]).

Η συνολική ποσότητα πρωτεΐνης μπορεί να μετρηθεί με διάφορες χρωματομετρικές δοκιμασίες [Bradford ή μικρο-βικινσονικό οξύ (BCA)] ή φθοριομετρικές δοκιμασίες ή με συνολική χρώση πρωτεΐνης σε SDS-PAGE. Η συγκέντρωση του δείγματος EV πρέπει να είναι εντός του γραμμικού εύρους της καμπύλης αναφοράς. Ωστόσο, ο ποσοτικός προσδιορισμός των πρωτεϊνών μπορεί να οδηγήσει σε υπερεκτίμηση λόγω των συν-απομονωμένων πρωτεϊνικών προσμίξεων (όπως η λευκωματίνη από το μέσο καλλιέργειας ή το πλάσμα/ορό), ιδίως όταν χρησιμοποιούνται οι λιγότερο ειδικές μέθοδοι διαχωρισμού των EV, ή αντίθετα μπορεί να αποδειχθεί ότι δεν είναι αρκετά ευαίσθητη εάν οι πολύ ειδικές μέθοδοι αποδίδουν καθαρά EV. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μπορεί να διαφέρουν ανάλογα με τη χρήση ή μη απορρυπαντικού για τη διάσπαση των EVs και την έκθεση ολόκληρου του πρωτεϊνικού περιεχομένου πριν από τη διεξαγωγή της ανάλυσης- πρέπει να αναφέρεται η φύση και η συγκέντρωση του απορρυπαντικού.

Η ποσοτικοποίηση των ολικών λιπιδίων μπορεί να επιτευχθεί, π.χ. με τη δοκιμασία σουλφοφωσφοβανιλίνης [186], με τη μέτρηση του φθορισμού των χρωστικών φωσφολιπιδίων που φθορίζουν μόνο όταν ενσωματώνονται σε λιπιδικές διπλοστιβάδες, όπως η DiR [187], ή με φασματοσκοπία υπερύθρου με ολική ανάκλαση Fourier-μετασχηματισμού [188]. Ωστόσο, η τελευταία απαιτεί εξειδικευμένο εξοπλισμό, ενώ οι δύο πρώτοι τύποι δοκιμών μπορεί να μην είναι επαρκώς ευαίσθητοι για μικρές ποσότητες EVs. Επιπλέον, πρέπει ακόμη να διαπιστωθεί κατά πόσον αυτές οι τεχνικές ανιχνεύουν εξίσου όλα τα EVs ανεξάρτητα από την ειδική λιπιδική τους σύνθεση.

Η ποσοτικοποίηση του ολικού RNA μπορεί να πραγματοποιηθεί με συνολικές αναλύσεις RNA, συμπεριλαμβανομένων των προφίλ που λαμβάνονται από όργανα τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (βλέπε συστάσεις στον πίνακα 1 του [56]). Ωστόσο, τέτοιες μετρήσεις είναι δύσκολο να προταθούν προς το παρόν για ποσοτικοποίηση ή δοκιμές καθαρότητας των EV, δεδομένου ότι τα exRNA συνδέονται σε αφθονία με άλλες κυκλοφορούσες και δυνητικά συνδιαχωριζόμενες οντότητες: κυρίως ριβονουκλεοπρωτεΐνες [189,190], αλλά και μια σειρά σωματιδίων, συμπεριλαμβανομένων των εξωμερών [112] και των λιποπρωτεϊνών [191]. Οι μετρήσεις του RNA παραμένουν, ωστόσο, μια σημαντική παράμετρος που πρέπει να αναφέρεται στις μελέτες του εξωκυτταρικού RNA.

Ποσοτικοποίηση συγκεκριμένων μορίων. Άλλες μέθοδοι ποσοτικοποίησης EV, όπως η ELISA [192] η κυτταρομετρία ροής με σφαιρίδια [193,194], οι χρωματομετρικές δοκιμασίες με βάση τα απταμερή και τους νανοσωλήνες άνθρακα [195] και η SPR σε επιφάνειες όπως οι νανοράβδοι επικαλυμμένες με αντισώματα [178,196,197], μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ποσοτικοποίηση της ποσότητας ενός ή περισσότερων ειδικών μορίων στο παρασκεύασμα EV. Αυτά είναι γενικά πρωτεΐνες (συνήθως οι τετρασπανίνες CD9, CD63 ή/και CD81, αλλά μερικές φορές ειδικές για τον όγκο πρωτεΐνες ή άλλα μόρια, όπως λιπίδια [139]) και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση της ποσότητας των EV που περιέχουν το συγκεκριμένο συστατικό και όχι των συνολικών EV. Αυτές οι μέθοδοι παρέχουν πρόσθετες πληροφορίες στις παραπάνω μεθόδους και είναι σύμφωνες με τον χαρακτηρισμό που συνιστάται στο μέρος 4β (σ. 16).

Μοναδικές και πολλαπλές μετρήσεις και επιπτώσεις στην καθαρότητα. Οι μέθοδοι ποσοτικού προσδιορισμού είναι οι πιο κατατοπιστικές για τα EV που ανακτώνται με μεθόδους διαχωρισμού με την υψηλότερη αναμενόμενη ειδικότητα (πίνακας 1α-κατηγορία 3) και για τα παρασκευάσματα αυτά μπορεί να αρκεί μία μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού- αντίθετα, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία ποσοτικές μετρήσεις για τα EV που ανακτώνται με μεθόδους χαμηλής ειδικότητας. Είναι σημαντικό ότι οι λόγοι των διαφόρων μεθόδων ποσοτικοποίησης μπορούν να παρέχουν χρήσιμα μέτρα καθαρότητας. Για παράδειγμα, ο λόγος πρωτεΐνη:σωματίδιο [198,199], ο λόγος πρωτεΐνη:λιπίδιο [186,188,200] και ο λόγος RNA:σωματίδιο [201] έχουν προταθεί ως πιθανές μετρικές καθαρότητας, αν και η εφαρμοσιμότητά τους σε όλες τις μεθόδους ποσοτικοποίησης πρωτεϊνών, λιπιδίων, RNA και σωματιδίων μένει να καθοριστεί. Τεχνικές που μετρούν πολλαπλές παραμέτρους ταυτόχρονα, όπως οι κολλοειδείς νανοπλασμονικές δοκιμασίες ή η φασματοσκοπία υπερύθρου (IR) [188,199] μπορεί να είναι καλές προαιρετικές μέθοδοι, παρά την ανάγκη για ειδικούς αισθητήρες ή άλλο εξοπλισμό.

Οι μέθοδοι απόλυτης διαστασιολόγησης και καταμέτρησης των EV είναι επί του παρόντος ατελείς και θα απαιτήσουν περαιτέρω βελτίωση, υποβοηθούμενες από κατάλληλα πρότυπα αναφοράς EV που βρίσκονται τώρα υπό ανάπτυξη [202]. Παρ’ όλα αυτά, οι τρέχουσες μέθοδοι μπορούν να παρέχουν μια λογική ένδειξη των σωματιδίων ανά όγκο και των κατανομών μεγέθους σωματιδίων που ερμηνεύονται καλύτερα όταν συνδυάζονται με τον γενικό (Πίνακας 2β) και τον χαρακτηρισμό μεμονωμένων σωματιδίων (Πίνακας 2γ).

-#- Χαρακτηρισμός των EVs με βάση την πρωτεϊνική τους σύνθεση

Επιλογή πρωτεϊνών για χρήση ως δεικτών EV. Από το MISEV2014, η αυξανόμενη αναγνώριση της ύπαρξης πολλών διαφορετικών τύπων EVs, διαφορετικών μεγεθών και κυτταρικής προέλευσης, οδήγησε στη δημοσίευση πολλών μελετών που συγκρίνουν την πρωτεϊνική σύνθεση τουλάχιστον δύο υποτύπων EVs που απομονώθηκαν από τα ίδια κύτταρα που εκκρίνουν. Ορισμένες μελέτες συνέκριναν τα EVs που ανακτήθηκαν με φυγοκέντρηση μέσης ταχύτητας (τα οποία ονομάζονται μεγάλα ογκοσωμάτια [203], εκτοσωμάτια [204], μικροβυστίδια [205], κυτταρικά υπολείμματα [206] ή μεγάλα [207] ή μεσαία [208] EVs), με εκείνα που ανακτήθηκαν με υπερφυγοκέντρηση 100.000 x g (τα οποία ονομάζονται εξωσώματα στις τέσσερις πρώτες μελέτες, μικρά EVs στις δύο τελευταίες), ενώ αρκετές από αυτές εφάρμοσαν πρόσθετο διαχωρισμό σε βαθμίδες πυκνότητας. Μια άλλη μελέτη χρησιμοποίησε διαφορική διήθηση για τον διαχωρισμό των μεγάλων μικροκυψελίδων που συγκρατούνται από φίλτρα 0,65 micron και των μικρών “εξωσωμάτων” που περνούν από φίλτρα 0,1 micron [209]. Άλλοι διαχώρισαν περαιτέρω το σφαιρίδιο υψηλής ταχύτητας για τον εντοπισμό υποπληθυσμών μικρών EVs που φέρουν διαφορετικούς επιφανειακούς δείκτες, όπως το αντιγόνο A33 (GPA33) έναντι EPCAM [19], λιπιδικά τμήματα που δεσμεύουν την τοξίνη της χολέρας, την Annexin-V ή την τοξίνη Shiga [139] ή τις τετρασπανίνες CD63, CD9 ή/και CD81 [208]. Τα EVs διαχωρίστηκαν επίσης με επίπλευση σε διαφορετικές πυκνότητες εντός κλίσης σακχαρόζης (που ορίστηκε ως υψηλή πυκνότητα “HD-exo” έναντι χαμηλής πυκνότητας “LD-exo”) [210] ή με έκλουση σε διαφορετικά χρονικά σημεία σε ασύμμετρη κλασματοποίηση πεδίου ροής (AF4) (μικρό “exo-S” έναντι μεγάλου “exo-L”) [112]. Αυτές οι μελέτες μαζί παρέχουν μια πλούσια πηγή δυνητικών δεικτών ειδικών για τον υποτύπο EV. Ωστόσο, δεδομένου ότι πραγματοποιήθηκαν με διαφορετικές προσεγγίσεις διαχωρισμού και με διαφορετικές κυτταρικές πηγές EVs, δεν είναι ακόμη δυνατό να προταθούν ειδικοί και καθολικοί δείκτες του ενός ή του άλλου τύπου EVs, πόσο μάλλον των “εξωσωμάτων” που προέρχονται από MVB σε σύγκριση με άλλα μικρά EVs.

Κατά συνέπεια, το MISEV2018 δεν προτείνει μοριακούς δείκτες που θα μπορούσαν να χαρακτηρίσουν ειδικά κάθε υποτύπο EV. Σημειωτέον, παρόλο που το συμβούλιο του ISEV προσπάθησε στο MISEV2014 να προτείνει γενικούς κανόνες που ισχύουν για όλα τα EVs, ορισμένες προτάσεις του MISEV2014 εξακολουθούσαν να είναι προκατειλημμένες από μια άποψη των EVs με προσανατολισμό στα “εξωσώματα”. Συγκεκριμένα, ο πίνακας 1 του MISEV2014 απαριθμούσε, ως πρωταρχικά συστατικά προς ανάλυση στα EVs, 2 κατηγορίες πρωτεϊνών που υπάρχουν ή εμπλουτίζονται στα EVs/εξωσώματα (μεμβρανικές και κυτταρικές πρωτεΐνες), καθώς και μια άλλη συνολική κατηγορία πρωτεϊνών που “δεν αναμένονται στα EVs/εξωσώματα” (όπως μιτοχόνδρια, Golgi ή πυρηνικές πρωτεΐνες) και μια τελευταία κατηγορία “μολυσματικών ουσιών”. Σε αυτή την επικαιροποιημένη έκδοση, MISEV2018, η αναφορά στα εξωσώματα και στις πρωτεΐνες που αναμένονται ή δεν αναμένονται σε αυτά (οι προηγουμένως αποκαλούμενοι “αρνητικοί έλεγχοι” των παρασκευασμάτων “εξωσωμάτων”) έχουν διαγραφεί, αντανακλώντας την εξελισσόμενη κατανόηση των υποτύπων των EVs και των συσχετίσεών τους με άλλες οντότητες”.

-#- Νέα σύσταση: προσδιορίστε την τοπολογία των συστατικών που σχετίζονται με τα EV

“Είναι σημαντικό ότι η τοπολογία του luminal έναντι της επιφάνειας των διαφόρων συστατικών που σχετίζονται με τα EV, συμπεριλαμβανομένων των νουκλεϊκών οξέων, των πρωτεϊνών, των γλυκανών κ.λπ. δεν είναι απολύτως αυστηρά καθορισμένη. Θεωρητικά, τα συστατικά που εντοπίζονται στο κυτταρόλυμα των κυττάρων που εκκρίνουν EV θα πρέπει να βρίσκονται στο εσωτερικό των EV και, ως εκ τούτου, να προστατεύονται από την ήπια αποικοδόμηση από πρωτεάσες ή νουκλεάσες. Ενώ αυτή η προστασία παρατηρείται συνήθως, σε ορισμένες μελέτες βρέθηκαν απροσδόκητα πρωτεΐνες [266], RNAs [267] και DNA [41] στην επιφάνεια των EV και ευαίσθητα στην πέψη. Δεν είναι ακόμη σαφές αν αυτή η απροσδόκητη τοπολογία οφείλεται σε υπολείμματα από νεκρά ή ετοιμοθάνατα κύτταρα ή είναι αντίθετα το αποτέλεσμα άγνωστων ακόμη μηχανισμών μεταφοράς ενδοκυττάριων διαμερισμάτων μέσω μεμβρανών που θα μπορούσαν να συμβαίνουν σε ορισμένες φυσιολογικές ή παθολογικές καταστάσεις. Σίγουρα, ακόμη και ένας μικρός βαθμός μόλυνσης με ενδοκυτταρικό υλικό (με την αντίστροφη τοπολογία σε σχέση με τα EVs) θα περιέπλεκε την ερμηνεία”.

-#- Λειτουργικές μελέτες: πώς εξελίσσεται το MISEV2014 το 2018

“Ο πίνακας 4 συνοψίζει τις προηγούμενες και επικαιροποιημένες συστάσεις σχετικά με τη λειτουργική ανάλυση των EVs. Λεπτομερέστερη αιτιολόγηση αυτών των συστάσεων και των προτεινόμενων πρωτοκόλλων ακολουθεί τον Πίνακα. Οι στόχοι αυτών των συστάσεων είναι να αποφευχθούν οι υπερερμηνείες ή τα κλασικά τεχνουργήματα κατά την ανάλυση των λειτουργιών των EVs. Είναι σημαντικό να λαμβάνονται υπόψη διάφορα ζητήματα όταν αποδίδεται μια λειτουργική δραστηριότητα στα EVs γενικά ή σε έναν υποτύπο EV ειδικότερα. Περιγράφουμε εδώ τους ελέγχους και τις διαδικασίες που πρέπει να περιλαμβάνονται σε όλες τις λειτουργικές μελέτες, εκτός εάν οι περιορισμένες ποσότητες καθιστούν αδύνατη την εκτέλεσή τους. Για κλινικές εφαρμογές, για παράδειγμα, μετά από ένα πρώτο βήμα προκλινικής επικύρωσης που ακολουθεί αυτές τις συστάσεις, η συστηματική ανάλυση μπορεί να μην είναι δυνατή (βλ. προηγούμενο έγγραφο θέσης για τις κλινικές εφαρμογές) [95].

-#- Καθορισμός των ειδικών έναντι των κοινών λειτουργιών των διαφόρων τύπων EVs

Ένα σημαντικό σημείο που πρέπει να έχουμε κατά νου είναι ότι, όταν αναλύουμε αποκλειστικά τη λειτουργία ενός μόνο τύπου EV (για παράδειγμα, είτε μικρά EVs είτε μεγάλα EVs που έχουν ονομαστεί εκτοσώματα, μικροκυψελίδες ή μικροσωματίδια σε διάφορες μελέτες), μπορεί να χάσουμε τον πιο ενεργό υποτύπο EV για τη συγκεκριμένη λειτουργία που μελετάται. Ακόμη και αν μια λειτουργία βρεθεί στο συμπυκνωμένο παρασκεύασμα μικρών EV, θα μπορούσε επίσης να είναι παρούσα, και μάλιστα ενδεχομένως πιο συγκεντρωμένη, σε άλλους υποτύπους EV που είχαν εξαλειφθεί κατά τη διαδικασία απομόνωσης των μικρών EV: διατηρώντας τα μεγάλα EV (π.χ. “μικροκυψελίδες”) και η σύγκριση της δραστηριότητάς τους με εκείνη των μικρών EVs θα πρέπει να αποτελεί ένα πρώτο βήμα σε όλες τις λειτουργικές μελέτες. Επιπλέον, όταν μια λειτουργία που εντοπίζεται στα EVs μπορεί να οφείλεται σε διαλυτά μόρια που μπορεί ή δεν μπορεί να συσχετίζονται ειδικά με τα EVs, πρέπει να ληφθεί υπόψη η πιθανότητα ότι η λειτουργία που σχετίζεται με τα EVs είναι μόνο ένα μικρό κλάσμα της μη συνδεδεμένης με τα EVs διαλυτής πρωτεΐνης. Συγκρίνοντας ποσοτικά τις επιδράσεις των κλασμάτων EV, των κλασμάτων που έχουν μειωθεί σε EV, καθώς και του μη κλασματοποιημένου αρχικού υγρού, θα προσδιοριστούν οι σχετικές συνεισφορές του καθενός στη συνολική δραστηριότητα.

Παρεμπιπτόντως, αν και δεν εμβαθύνουμε πολύ σε αυτό το σημείο, πολλές λειτουργικές μελέτες προϋποθέτουν ή διερευνούν την πρόσληψη EV. Οι χρονικές ροές και οι περιβαλλοντικοί προσδιοριστικοί παράγοντες της πρόσληψης EV έχουν μελετηθεί εδώ και αρκετό καιρό [272-274], αλλά υπάρχουν προκλήσεις [275]. Η ανίχνευση εντός του κυττάρου σήματος από μια χρωστική σήμανσης EV ή άλλη οντότητα δεν σημαίνει απαραίτητα ότι το EV ή το φορτίο του έχει εσωτερικευτεί. Ορισμένες ουσίες σήμανσης είναι πολύ μακράς διάρκειας ζωής, μπορούν να υπάρχουν χωριστά από την πιθανώς επισημασμένη οντότητα και μπορούν να σχηματίσουν σωματίδια που μιμούνται τα EV και είναι δύσκολο να διαχωριστούν από τα EV. Ένα άλλο πιθανό τεχνούργημα είναι ότι η επισήμανση των EVs με λιπόφιλες ή επιφανειακές φθοροφόρες μπορεί να τροποποιήσει τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των EVs, μεταβάλλοντας έτσι τον τρόπο ανίχνευσης ή/και την πρόσληψη από τα κύτταρα-στόχους. Παρόλο που δεν μπορούμε ακόμη να διατυπώσουμε αυστηρές συστάσεις, παροτρύνουμε τους ερευνητές να έχουν επίγνωση αυτών των ζητημάτων και να λάβουν υπόψη τους ότι κάθε συγκεκριμένο ζεύγος EV-δότη/EV-δέκτη μπορεί να συμπεριφέρεται με διαφορετικό τρόπο”.

-#- Απόδειξη ότι η δραστηριότητα συνδέεται κυρίως με τα EV και όχι με διαλυτούς μεσολαβητές

“Συνήθως, μια δραστηριότητα που σχετίζεται με EV διερευνάται με 1) διαχωρισμό και συγκέντρωση EVs από ένα βιορευστό ή μέσο κυτταροκαλλιέργειας, 2) εφαρμογή EVs σε ένα κύτταρο ή οργανισμό-δέκτη και 3) παρατήρηση ενός φαινότυπου ανάγνωσης. Ωστόσο, για να υποστηριχθεί πειστικά ότι μια ανιχνευόμενη ανάγνωση/λειτουργία είναι EV-γενής, πρέπει να προσδιοριστεί ότι η δραστηριότητα είναι ειδικά εμπλουτισμένη στα EVs (ενδεχομένως με συστατικά που δεν ανήκουν στα EV) και όχι, αντίθετα, λόγω χαμηλών ποσοτήτων ενός εξαιρετικά δραστικού διαλυτού μορίου που παραμένει μη ειδικά στο παρασκεύασμα EV. Αυτό το σημείο είναι ιδιαίτερα σημαντικό όταν το προτεινόμενο ή υποτιθέμενο ενεργό μόριο στα EV είναι μια κυτταροκίνη/ένας παράγοντας ανάπτυξης/ένας μεταβολίτης που συνήθως περιγράφεται ως εκκρινόμενο σε διαλυτή μορφή. Για το βήμα αυτό, πρέπει να συγκριθεί ποσοτικά η δραστικότητα που υπάρχει στα/επάνω στα EVs σε σχέση με το υπόλοιπο βιορευστό που έχει υπολειφθεί από τα EVs, χρησιμοποιώντας τις ίδιες ποσότητες υλικών όσον αφορά τον αρχικό όγκο του βιορευστού. Κατά την αξιολόγηση της σχετικής σημασίας των EVs και των διαλυτών μεσολαβητών, ίσως αξίζει να θυμόμαστε ότι τα EVs και οι διαλυτοί μεσολαβητές μπορεί να έχουν συνδυαστικές (π.χ. συνεργιστικές) επιδράσεις στα κύτταρα [275,276].

-#- Απόδειξη της ειδικής συσχέτισης της δραστηριότητας με τα EVs και όχι με συν-απομονωμένα συστατικά

Ιδιαίτερα όταν πρόκειται για συμπυκνωμένα παρασκευάσματα εμπλουτισμένα σε μικρά EVs, πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι τα παρασκευάσματα αυτά ενδεχομένως περιέχουν συστατικά που δεν είναι EVs (συσσωματώματα ριβονουκλεοπρωτεϊνών, λιποπρωτεΐνες, εξωμερή κ.λπ.) Η αναλογία αυτών των συναπομονωμένων συστατικών διαφέρει σε μεγάλο βαθμό ανάλογα με τον τύπο του πρωτοκόλλου που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό των EVs, με ορισμένα (όπως η συγκέντρωση με βάση το πολυμερές) να εμφανίζουν ιδιαίτερα άφθονες προσμίξεις, καθώς και υπολείμματα του κατακρημνιστικού παράγοντα που μπορεί να επηρεάσουν τη λειτουργία των κυττάρων [277,278]. Στην περίπτωση κυττάρων που έχουν μολυνθεί πειραματικά ή ακούσια (π.χ. μυκόπλασμα) με μικρόβια, οι λειτουργικοί μικροβιακοί παράγοντες μπορεί επίσης να συναπομονώνονται με τα EVs. Επομένως, η λειτουργική δραστηριότητα ενός παρασκευάσματος EV μπορεί να φέρεται από τα EVs ή από τα πρόσθετα συστατικά ή από συνδυασμό και των δύο. Πρέπει να προσδιοριστεί ποια από αυτές τις τρεις πιθανότητες ισχύει. Εάν οι μικρές ποσότητες υλικών εργασίας δεν καθιστούν δυνατή τη διενέργεια αυτών των πρόσθετων ερευνών, οι συγγραφείς μπορούν να εξηγήσουν αυτή την κατάσταση και να ερμηνεύσουν τα δεδομένα τους ως δραστηριότητα που υπάρχει σε παρασκευάσματα εμπλουτισμένα με EV, και όχι ως ειδική για τα EV δραστηριότητα”.

-#- Καθορισμός του κατά πόσον μια λειτουργία είναι ειδική για τα εξωσώματα, σε σύγκριση με άλλα μικρά EVs

“Όπως τονίζεται εδώ, είναι πλέον σαφές ότι διαφορετικοί τύποι EVs μπορούν να παρουσιάσουν λειτουργικές δραστηριότητες που είναι εξίσου σημαντικές για διερεύνηση με εκείνες που προκαλούνται από τα εξεωσώματα που προέρχονται από τα όψιμα ενδοσώματα. Ωστόσο, την τελευταία δεκαετία, πολλές μελέτες έχουν επικεντρωθεί αποκλειστικά στην απόδειξη της συσχέτισης μιας συγκεκριμένης λειτουργίας με τα εξωσώματα. Η παρούσα ενότητα εξηγεί τους τεχνικούς περιορισμούς αυτών των μελετών και γιατί δεν αρκούν για να συμπεράνουμε, όπως γίνεται γενικά, ότι τα εξωσώματα έχουν συγκεκριμένες λειτουργίες σε σύγκριση με άλλα EVs”.

“Αυτές οι προσεγγίσεις κυτταρικής θεραπείας έχουν μεγάλες δυνατότητες και αξίζουν μεγαλύτερη ανάπτυξη- ωστόσο, είναι σημαντικό να αναγνωριστούν διάφορες επιφυλάξεις.

(1) Τα μικρά κλάσματα που περιέχουν EV περιέχουν δυνητικά EV που προέρχονται από τα όψιμα ενδοσώματα (“εξωσώματα”) και άλλα που προέρχονται από την κυτταρική επιφάνεια (πλασματική μεμβράνη), με τις δύο κατηγορίες να μοιράζονται κοινούς μοριακούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των συστατικών TSG101, VPS4 και/ή Alix του ESCRT [308-310]. Ως εκ τούτου, οι συνέπειες της μείωσης ή της αύξησης της συνολικής έκκρισης ετερογενών πληθυσμών μικρών EVs δεν θα πρέπει να ερμηνεύονται με όρους λειτουργικών επιδράσεων των εξωσωμάτων, αλλά μάλλον των μικρών EVs εν γένει.

(2) Τα εργαλεία που έχουν περιγραφεί μέχρι σήμερα για τον αποκλεισμό ή την ενίσχυση της έκκρισης των εξωσωμάτων δεν έχουν αξιολογηθεί επαρκώς ως προς την πιθανή επίδρασή τους στην έκκριση άλλων EVs. Για παράδειγμα, τα ιονοφόρα, όπως η ιονομυκίνη, είναι επίσης ισχυροί επαγωγείς της έκκρισης μεγάλων EV και μικροσωματιδίων [207,311]. Αντίθετα, σε μια μελέτη, η αναστολή των ουδέτερων σφιγγομυελινασών φάνηκε ότι ενισχύει την έκκριση των μεγαλύτερων EVs που προέρχονται από την πλασματική μεμβράνη, ενώ μειώνει εκείνη των μικρών EVs [312]. Ένα άλλο παράδειγμα είναι η μονενσίνη, που χρησιμοποιείται συχνά για τη διέγερση της έκκρισης EV, όντας αναστολέας του σχηματισμού αποπτωτικών σωμάτων [167]. Επομένως, είναι πιθανό ότι οι υποτιθέμενοι ρυθμιστές των εξωσωμάτων θα έχουν διαφορετικές συνέπειες σε διαφορετικά κύτταρα και υπό διαφορετικές συνθήκες και είναι σημαντικό να ποσοτικοποιείται προσεκτικά η τοξικότητα κάθε θεραπείας σε κάθε πειραματικό σύστημα, ώστε να αποκλείονται τεχνητές επιδράσεις στην ανάκτηση των EV λόγω αυξημένου κυτταρικού θανάτου.

(3) Ορισμένοι διαμορφωτές της απελευθέρωσης EV επηρεάζουν άλλα σημαντικά ενδοκυτταρικά μονοπάτια που ενδέχεται να επηρεάσουν έμμεσα την έκκριση EV και να τροποποιήσουν τις κυτταρικές λειτουργίες γενικά (όπως τα γενικά μονοπάτια ενδοκυτταρικής διακίνησης, έκκρισης ή αυτοφαγίας). Κατά συνέπεια, μπορεί να μεταβληθεί όχι μόνο η ποσότητα EV, αλλά και η σύνθεση EV, μαζί με αλλαγές στην έκφραση πρωτεϊνών και τη φυσιολογία των κυττάρων που εκκρίνουν. Ως παράδειγμα, η αναστολή του Rab27a μείωσε επίσης την έκκριση ορισμένων διαλυτών παραγόντων που δεν συνδέονται με το EV [313,314]. Μια άλλη προειδοποίηση που πρέπει να ληφθεί υπόψη είναι ότι η διακοπή της έκκρισης ενός τύπου EV μπορεί να διαταράξει την παραγωγή άλλων τύπων EV, έτσι ώστε ο λειτουργικός τύπος EV να καλυφθεί από την υπερπαραγωγή ενός ανταγωνιστικού τύπου, οδηγώντας σε εσφαλμένο συμπέρασμα ότι ο τύπος EV που διακόπηκε είναι ο λειτουργικός EV. Επομένως, η απόδειξη ότι μόνο τα εξοσώματα που προέρχονται από τα όψιμα ενδοσώματα φέρουν μια αναλυόμενη λειτουργία παραμένει πρόκληση. Ορισμένες προηγούμενες μελέτες κατάφεραν να διασώσουν ένα παρατηρούμενο αποτέλεσμα με την επανεισαγωγή καθαρισμένων εξωσωμάτων (ή μάλλον μικρών σφαιριδίων EV) στις λειτουργικές in vitro ή in vivo δοκιμές [292,313,314]. Η προσέγγιση αυτή συνιστάται πράγματι, με προσεκτική ερμηνεία λαμβάνοντας υπόψη τον βαθμό διάσωσης και την απαιτούμενη ποσότητα EVs.

Έως ότου επιτύχουμε την αδιαμφισβήτητη ταυτοποίηση συγκεκριμένων, μοναδικών μηχανισμών βιογένεσης που επηρεάζουν μόνο έναν συγκεκριμένο υποτύπο EVs, μένουμε στην προσπάθεια απομόνωσης υποτύπων EVs αφού αυτά έχουν εγκαταλείψει το κύτταρο. Για παράδειγμα, εάν τα EVs που φέρουν πολλαπλές τετρασπανίνες είναι αληθινά εξωσώματα σε ένα συγκεκριμένο κυτταρικό σύστημα, ένα παρασκεύασμα EV θα μπορούσε να εξαντληθεί από τέτοια EVs και η δραστηριότητα να ποσοτικοποιηθεί σε σύγκριση με εκείνη ενός άσχετου πληθυσμού με IgG ή ενός πληθυσμού που έχει εξαντληθεί με μάρτυρα.

-#- Πώς να αποδοθούν συγκεκριμένες επιδράσεις που διαμεσολαβούνται από EVs σε συγκεκριμένα συστατικά EV

Πολλές δημοσιεύσεις περιλαμβάνουν knock-out ή knock-down μιας συγκεκριμένης βιοδραστικής πρωτεΐνης ή RNA στο κύτταρο-δότη των EV, μετά την οποία συγκρίνονται οι επιδράσεις των τροποποιημένων EV στα κύτταρα-στόχους με τις επιδράσεις των μη τροποποιημένων EV. Εάν η εγγενής επίδραση των EVs χαθεί, οι συγγραφείς συμπεραίνουν ότι η δραστηριότητα των EVs οφειλόταν στην ειδικά στοχευμένη πρωτεΐνη ή το RNA. Ωστόσο, ένα τέτοιο συμπέρασμα μπορεί να είναι ή να μην είναι έγκυρο ελλείψει εκτεταμένου χαρακτηρισμού των EVs που απελευθερώνονται από τα κύτταρα που έχουν εξαντληθεί για το στοχευμένο μόριο. Πράγματι, η αφαίρεση της πρωτεΐνης/του RNA που ενδιαφέρει μπορεί επίσης να οδηγήσει σε σημαντικές μεταβολές του εκκριτικού κυττάρου, με αποτέλεσμα πρόσθετες αλλαγές στην ποσότητα ή το μοριακό περιεχόμενο των EVs, γεγονός που θα μπορούσε επίσης να εξηγήσει τις αλλαγές στις επιδράσεις που προκαλούνται από τα EV στα κύτταρα-στόχους. Ενώ μια πλήρης omics ανάλυση του τροποποιημένου πληθυσμού EV μπορεί να είναι πέρα από το πεδίο εφαρμογής πολλών μελετών, θα πρέπει να υπάρχει επίγνωση ότι μπορεί να έχουν αλλάξει και άλλα συστατικά EV.

Τουλάχιστον, πρέπει να πραγματοποιηθεί μια μικρής κλίμακας ανάλυση του αριθμού των EV ή των κοινών πρωτεϊνών που σχετίζονται με τα EV στις τροποποιημένες και τις WT συνθήκες. Τέλος, η άμεση μηχανική των EVs (π.χ. για την αφαίρεση του συγκεκριμένου υποτιθέμενου ενεργού μορίου) μπορεί να ξεπεράσει το ζήτημα των μεταβολών στα κύτταρα που εκκρίνουν. Ωστόσο, μπορεί επίσης να προκύψει πιθανή απώλεια/αλλοίωση του φορτίου EV λόγω χειραγώγησης των EV.

-#- Εξέταση αν μια λειτουργία που εξαρτάται από τα EV είναι ειδική για μια συγκεκριμένη πηγή EV.

Τέλος, σε όλες τις περιπτώσεις, πρέπει να είναι κανείς προσεκτικός όταν ισχυρίζεται μια συγκεκριμένη λειτουργία των EVs από μια συγκεκριμένη πηγή: είναι άλλο πράγμα να ισχυρίζεται κανείς ότι το κλάσμα EV από το κύτταρο X είναι ισχυρό (έναντι άλλων κλασμάτων) και άλλο να ισχυρίζεται ότι τα EVs του κυττάρου X είναι ισχυρά έναντι εκείνων από άλλα κύτταρα. Για παράδειγμα, τα EVs των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων (MSC) μου κάνουν κάτι ιδιαίτερο ή τα EVs του γάλακτος, τα EVs των ούρων, τα EVs των καρκινικών κυττάρων κάνουν το ίδιο; Φυσικά, δεν θα είναι δυνατόν να συγκριθούν EVs από όλες τις διαφορετικές πηγές, επομένως το τελικό μήνυμα πρέπει να αντικατοπτρίζει αυτή την αβεβαιότητα”.

-#- Εξαιρέσεις από τη συμμόρφωση με τις κατευθυντήριες γραμμές MISEV

Ενδέχεται να προκύψουν ορισμένες καταστάσεις στις οποίες η αυστηρή τήρηση των κατευθυντήριων γραμμών MISEV είναι δύσκολη. Δεν είναι διαθέσιμα όλα τα βιορευστά, για παράδειγμα το δακρυϊκό υγρό, σε επαρκή όγκο για τον διαχωρισμό των EVs και την εκτέλεση πολλαπλών δοκιμών με κάθε δείγμα- επίσης, μόνο περιορισμένος αριθμός EVs μπορεί να συλλεχθεί από μικρούς αριθμούς κυττάρων που προέρχονται από ασθενείς, μικρά οργανοειδή και άλλα. Σε τέτοιες περιπτώσεις, πολλαπλά δείγματα θα μπορούσαν να συγκεντρωθούν για να διαπιστωθεί η αξιοπιστία της/των μεθόδου/ων διαχωρισμού και να χαρακτηριστούν τα EVs πριν από την εκτέλεση περαιτέρω χαρακτηρισμού ή λειτουργικών μελετών με μεμονωμένα δείγματα. Εάν ακόμη και αυτή η λύση είναι ανέφικτη, οι συγγραφείς θα πρέπει να αναφέρουν το όριο ανίχνευσης κάθε εφαρμοζόμενης τεχνολογίας χαρακτηρισμού EV και να αποδεικνύουν ότι το διαθέσιμο υλικό πέφτει κάτω από αυτό το όριο. Ωστόσο, η εφαρμογή αυτής της “ρήτρας διαφυγής” σημαίνει ότι τα EVs δεν μπορούν να αποδειχθούν αυστηρά, απαιτώντας από τους συγγραφείς να αναφέρουν (και από τους κριτές να επιμένουν) τις επιφυλάξεις για εναλλακτικές ερμηνείες, δηλαδή ότι τα EVs μπορεί να συμβάλλουν, αλλά όχι απαραίτητα αποκλειστικά, σε ένα παρατηρούμενο φαινόμενο ή μοριακή υπογραφή”.

doi: 10.1080/20013078.2018.1535750.

Οι τεχνικές προκλήσεις που σχετίζονται με τον καθαρισμό και την απομόνωση των εξωσωμάτων έχουν οδηγήσει στη δημιουργία μεγάλου όγκου δεδομένων που δεν μπορούν να επαληθευτούν πειραματικά. Οι τεχνολογικές εξελίξεις που υποτίθεται ότι θα καθιέρωναν αποτελέσματα υψηλότερης ποιότητας δεν έχουν ακόμη καρποφορήσει. Οι τυποποιημένες προσεγγίσεις που υποτίθεται ότι θα καθιέρωναν επαληθεύσιμα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα δεν έχουν εφαρμοστεί ευρέως. Αυτό έχει οδηγήσει σε μια κρίση αναπαραγωγιμότητας στην έρευνα των εξωσωμάτων, η οποία συνεχίζεται ακόμη και σήμερα. Το πρόβλημα των ανακριβών δεδομένων, της ασυνεπούς αναφοράς και της έλλειψης αναπαραγωγής αντιμετωπίστηκε σε αυτή την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας για τα EV το 2021, συμπεριλαμβανομένου του ζητήματος της ύπαρξης ανεπαρκών μέσων απομόνωσης των εξωσωμάτων και διαφοροποίησής τους από τα μικροκυψελίδια. Στην πραγματικότητα, αναφέρεται ότι δεν υπάρχει κανένας δυνατός τρόπος να διαφοροποιηθούν σαφώς τα “μικροκυψελίδια” από τα “εξωσώματα” είτε με βάση τη μορφολογία, το μέγεθος ή τη λειτουργία τους και ότι συνιστάται όλα τα EVs να θεωρούνται ως ενιαία οντότητα:

–> Κριτική επισκόπηση της εξέλιξης της γνώσης των εξωκυτταρικών κυστιδίων”: Από το 1946 έως σήμερα

“Προκειμένου να επανεξεταστεί συστηματικά ο αντίκτυπος των κριτηρίων ISEV του 2013 για τον χαρακτηρισμό των EVs στην επιστημονική παραγωγή, η κοινοπραξία της βάσης γνώσεων EV-TRACK συγκλήθηκε για την καταγραφή των πειραματικών παραμέτρων των μελετών που σχετίζονται με τα EV [5]. Η ανασκόπηση ενός καταλόγου ελέγχου 115 παραμέτρων με βάση τις κατευθυντήριες γραμμές MISEV, που αφορούσε τον τύπο του δείγματος, τις προ-αναλυτικές μεταβλητές, το πρωτόκολλο απομόνωσης και τη μέθοδο χαρακτηρισμού σε 1742 πειράματα που δημοσιεύθηκαν την περίοδο 2010-2015, αποκάλυψε εκτεταμένη ετερογένεια στις μεθόδους απομόνωσης EV και ασυνεπή αναφορά σημαντικών πειραματικών παραμέτρων [1-3,5]. Επιπλέον, είναι σημαντικό να υπογραμμιστεί ότι μόνο το 18% των πειραμάτων περιλαμβάνει τόσο ποιοτική όσο και ποσοτική ανάλυση και το 50% δεν πέτυχε πάνω από το 20% του EV-METRIC (ένας κατάλογος ελέγχου για την αξιολόγηση της πληρότητας της αναφοράς γενικών και ειδικών για τη μέθοδο πληροφοριών που είναι απαραίτητες για την ερμηνεία και την αναπαραγωγή του πειράματος, σύμφωνα με την αναφορά [5]). Οι αναλύσεις αυτές αποκάλυψαν ότι μεγάλος αριθμός δημοσιεύσεων σχετικά με τα EV περιείχε ανεπαρκείς πληροφορίες για την αδιαμφισβήτητη ερμηνεία ή την αναπαραγωγή των πειραμάτων [5]”.

“Ήταν επαρκώς προφανές και ανησυχητικό για τους εμπειρογνώμονες της κοινότητας ISEV ότι η συνεχής μεγάλη αύξηση των δημοσιεύσεων EV συχνά ανέφερε σημαντικά συμπεράσματα που δεν υποστηρίζονταν επαρκώς από τα πειράματα που είχαν διεξαχθεί ή τις πληροφορίες που αναφέρονταν. Οι συνθήκες αυτές οδήγησαν σε αναθεώρηση και ανανέωση των συστάσεων της MISEV που επικαιροποίησαν τις νέες γνώσεις στον τομέα, μαζί με τη δέσμευση της ISEV να συνεχίσει να εργάζεται για την ευρύτερη αποδοχή και εφαρμογή τους.”

“Επειδή τα εξωσώματα αναλύονται ως επί το πλείστον ως μαζικές απομονώσεις, η ετερογένειά τους ως προς τη σύνθεση και τον πληθυσμό συχνά παραβλέπεται. Εξακολουθεί να αποτελεί πρόκληση η απομόνωση συγκεκριμένων πληθυσμών εξωσωμάτων και απαιτούνται επειγόντως τεχνολογικές εξελίξεις για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος.

Οι περισσότερες από τις πρόσφατες βασικές έρευνες σχετικά με τα EVs επικεντρώνονται στα εξωσώματα που προέρχονται από MVB, με ελάχιστες ή καθόλου προσπάθειες για τη διερεύνηση των EVs που προέρχονται από μεμβράνες 100 έως 1000 nm (“μικροσωματίδια”). Φαίνεται ότι επί του παρόντος δεν υπάρχει κανένας δυνατός τρόπος να διαφοροποιηθούν σαφώς τα “μικροκυψελίδια” από τα “εξωσώματα” είτε με βάση τη μορφολογία, είτε με βάση το μέγεθος, είτε με βάση τη λειτουργία- συνεπώς, συνιστάται να θεωρούνται όλα τα EVs ως ενιαία οντότητα. Ωστόσο, το γεγονός ότι δεν μπορούμε να τα διαφοροποιήσουμε από τη στιγμή που απελευθερώνονται από το κύτταρο δεν σημαίνει απαραίτητα ότι είναι όλα τα ίδια. Θα έπρεπε να είναι διαφορετικά, αλλά δεν μπορούμε να τα ξεχωρίσουμε”.

https://www.google.com/url?sa=t&source=web&rct=j&url=https://www.mdpi.com/1422-0067/22/12/6417/pdf%3Fversion%3D1623888852&ved=2ahUKEwj8iJ_oqeX4AhW3JjQIHT5gArEQFnoECBEQAQ&usg=AOvVaw0XLQh9NS0ZATrsLUKy_V7j

Τον Ιούνιο του 2022 δημοσιεύθηκε μια ανασκόπηση της αναπαραγωγιμότητας της έρευνας των εξωσωμάτων. Σε αυτή την ανασκόπηση, μπορούμε να βρούμε πολλούς λόγους για την αδυναμία αναπαραγωγής της έρευνας των εξωσωμάτων. Αναφέρεται ότι η ετερογένεια (η ποιότητα ή η κατάσταση της ποικιλομορφίας ως προς τον χαρακτήρα ή το περιεχόμενο) των EVs επηρεάζει την ικανότητα απομόνωσης και ανίχνευσής τους. Γίνεται δεκτό ότι δεν υπάρχουν διακριτοί πληθυσμοί μικρών και μεγάλων EVs. Στην πραγματικότητα, το μέγεθος των EVs που περιέχονται σε ένα παρασκεύασμα εξαρτάται εξ ολοκλήρου από την/τις επιλεγμένη/ες μέθοδο/ες που χρησιμοποιείται/ονται για τον διαχωρισμό ή τον εμπλουτισμό του δείγματος. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον καθαρισμό/απομόνωση παρέχει διαφορετικά παρασκευάσματα EV ακόμη και από το ίδιο αρχικό υλικό, αποδεικνύοντας έτσι ότι η ίδια η μέθοδος καθαρισμού είναι αυτή που δημιουργεί το μέγεθος των σωματιδίων που παρατηρούνται καθώς διασπώνται σε μικρότερα κομμάτια.

Αποδεικνύεται επίσης ότι τα παρασκευάσματα EV περιέχουν πολλά μη EV συστατικά, γεγονός που καθιστά τον διαχωρισμό και την απομόνωση πρόκληση. Παρόλο που είναι γνωστό ότι θα υπάρχουν και άλλες ουσίες στα δείγματα, δεν δίνεται επαρκής προσοχή στους κρίσιμους συγχυτικούς παράγοντες που δεν έχουν ακόμη αναγνωριστεί πλήρως. Λόγω αυτών των παραγόντων, η ανίχνευση, η διάκριση και η απομόνωση των EVs με οπτικά μέσα αποτελεί πρόκληση και η παρουσία σωματιδίων μη EV μπορεί να παρεμποδίσει τον διαχωρισμό και τον χαρακτηρισμό των EVs. Αυτό έχει οδηγήσει στον γενικό κανόνα ότι όταν τα EVs απομονώνονται με μια μέθοδο, (δηλαδή μια μέθοδο που απομονώνει τα EVs με βάση το μέγεθος, το φορτίο, την πυκνότητα ή τη βιοχημική σύνθεση), τα απομονωμένα EVs είναι πιθανό να είναι ακάθαρτα και να περιέχουν συγχυτικούς παράγοντες. Η εργασία καταλήγει στο συμπέρασμα ότι η έρευνα για τα EV εργάζεται προς ένα αναπαραγώγιμο πρότυπο, εστιάζοντας στην υποδομή και τη βαθμονόμηση των οργάνων, η οποία προσφέρει την υπόσχεση της αναπαραγωγιμότητας, δείχνοντας έτσι ότι μέχρι σήμερα δεν έχει λυθεί αυτή η αδυναμία επαλήθευσης των πειραματικών αποτελεσμάτων με αναπαραγωγή και επανάληψη:

–> Αναπαραγωγιμότητα της έρευνας των εξωκυτταρικών κυστιδίων

“Τα κύτταρα απελευθερώνουν στο περιβάλλον σωματίδια που περιορίζονται στη μεμβράνη. Τα σωματίδια αυτά ονομάζονται “εξωκυτταρικά κυστίδια” (EVs) και τα EVs υπάρχουν σε υγρά που έρχονται σε επαφή με τα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των σωματικών υγρών και των κλιματιζόμενων μέσων καλλιέργειας. Επειδή τα EVs αλλάζουν και συμβάλλουν στην υγεία και την ασθένεια, τα EVs έχουν γίνει ένα καυτό θέμα. Από τις χιλιάδες εργασίες που δημοσιεύονται πλέον για τα EVs ετησίως, εύκολα αποκτά κανείς την εντύπωση ότι τα EVs παρέχουν βιοδείκτες για όλες τις ασθένειες και ότι τα EVs είναι φορείς όλων των σχετικών βιομορίων και είναι παντοδύναμα θεραπευτικά μέσα. Ταυτόχρονα, τα EVs είναι ετερογενή, ασύλληπτα και δύσκολα μελετήσιμα λόγω των φυσικών ιδιοτήτων τους και της πολύπλοκης σύνθεσης του περιβάλλοντός τους.

Αυτή η επισκόπηση εξετάζει τις τρέχουσες προκλήσεις που αντιμετωπίζονται κατά την εργασία με τα EVs και πώς οραματιζόμαστε ότι οι περισσότερες από αυτές τις προκλήσεις θα ξεπεραστούν στο εγγύς μέλλον. Αυτή τη στιγμή, αναπτύσσεται μια υποδομή για τη βελτίωση της αναπαραγωγιμότητας των αποτελεσμάτων των μετρήσεων των EV. Η υποδομή αυτή περιλαμβάνει ομάδες εργασίας εμπειρογνωμόνων της Διεθνούς Εταιρείας Εξωκυτταρικών Σωματιδίων (ISEV) που αναπτύσσουν κατευθυντήριες γραμμές και συστάσεις, βαθμονόμηση οργάνων, τυποποιημένη και διαφανή αναφορά και εκπαίδευση. Συνολικά, οι εξελίξεις αυτές θα στηρίξουν την αξιοπιστία της έρευνας για τα EV με την εισαγωγή ισχυρής αναπαραγωγιμότητας, η οποία αποτελεί προϋπόθεση για την κατανόηση της βιολογικής τους σημασίας και του δυναμικού τους ως βιοδείκτες”.

–> 1. Εισαγωγή

Τα εξωκυττάρια κυστίδια (EVs) είναι ένας γενικός όρος για διάφορους τύπους κυστιδίων που απελευθερώνονται από τα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των εξωσωμάτων που προέρχονται από τα ενδοσώματα και των εκτοσωμάτων ή μικροκυψελίδων που προέρχονται από την πλασματική μεμβράνη των ζωντανών κυττάρων, καθώς και των αποπτωτικών σωμάτων των αποπτωτικών κυττάρων (Yáñez-Mó et al., 2015). Ο όρος “εξωκυτταρικά κυστίδια” εισήχθη από τη Διεθνή Εταιρεία Εξωκυτταρικών Κυστιδίων (ISEV), επειδή οι διάφοροι τύποι EVs είναι συχνά δυσδιάκριτοι (Théry et al., 2018). Η μελέτη των EVs αποτελεί πρόκληση για διάφορους λόγους, οι οποίοι θα περιγραφούν συνοπτικά στο Μέρος 2: Προκλήσεις. Οι προκλήσεις αυτές θα επεξηγηθούν με την επεξήγηση σχετικών παραδειγμάτων, τα οποία περιλαμβάνουν τις φυσικές ιδιότητες των EVs που διέπουν την ετερογένειά τους και τον τρόπο με τον οποίο η ετερογένεια αυτή επηρεάζει την απομόνωση και την ανίχνευση, την πολυπλοκότητα του αίματος για την επεξήγηση των δυσκολιών που αντιμετωπίζονται κατά τη μελέτη των EVs σε ένα σωματικό υγρό και την κυτταρομετρία ροής ως μέθοδο ανίχνευσης EV που πιθανότατα θα παράγει αναπαραγώγιμα αποτελέσματα μετρήσεων στο εγγύς μέλλον.

–>2. Προκλήσεις

-#- 2.1. Ετερογένεια των εξωκυτταρικών κυστιδίων

Οι πρώτες κατανομές μεγέθους των EVs που δημοσιεύθηκαν για το ανθρώπινο πλάσμα και τα ούρα το 2014, έδειξαν ότι τα EVs κυμαίνονται σε διάμετρο από λιγότερο από < 100 nm έως 1 μm ή και περισσότερο (van der Pol et al., 2014; Arraud et al., 2014). Αυτές οι δημοσιεύσεις ήταν σημαντικές για διάφορους λόγους. Πρώτον, οι κατανομές μεγέθους έδειξαν ότι δεν υπάρχουν διακριτές κορυφές “μικρών EVs” και “μεγάλων EVs” (όπως υποτίθεται κάποτε για τα εξωσώματα και τα μικροκυψελίδια), αλλά ότι τα EVs μπορούν να έχουν σχεδόν οποιοδήποτε μέγεθος ή διάμετρο σε ένα συνεχές. Με άλλα λόγια, με βάση το μέγεθος, δεν υπάρχουν διακριτοί πληθυσμοί μικρών και μεγάλων EVs. Έτσι, το μέγεθος των EVs που περιέχονται σε ένα παρασκεύασμα εξαρτάται από τη φυσική βάση της επιλεγμένης μεθόδου (ή των μεθόδων) που χρησιμοποιείται (ή χρησιμοποιούνται) για τον διαχωρισμό ή τον εμπλουτισμό του δείγματος και διαφορετικές μέθοδοι θα παρέχουν διαφορετικά παρασκευάσματα EV ξεκινώντας από το ίδιο ακριβώς υλικό (Veerman et al., 2021)”.

“Εκτός από την ετερογένειά τους ως προς το μέγεθος, η πυκνότητα των EVs προκαλεί επίσης προκλήσεις, ιδίως κατά την απομόνωση των EVs. Για παράδειγμα, στην περίπτωση του πλάσματος αίματος και του ορού, η πυκνότητα των EVs ελάχιστα διαφέρει από την πυκνότητα του περιβάλλοντός τους και αυτή η χαμηλή “αντίθεση πυκνότητας” καθιστά δύσκολη την απομόνωση των EVs με φυγοκέντρηση (Rikkert et al., 2020). Είναι σημαντικό ότι υγρά όπως το πλάσμα αίματος και ο ορός περιέχουν επίσης σωματίδια μη EV, όπως σωματίδια λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (Yuana et al., 2014) και αιμοπετάλια (Rikkert et al., 2020), τα οποία επικαλύπτονται σε πυκνότητα με τα EVs. Έτσι, η απομόνωση των EVs του πλάσματος αίματος με φυγοκέντρηση διαβάθμισης πυκνότητας είναι πολύπλοκη (Zhang et al., 2020).

Όσον αφορά τη βιοχημική σύνθεση, τα EVs περιέχουν λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα, μεταβολίτες και πρωτεΐνες (Yáñez-Mó et al., 2015). Μέχρι στιγμής, η γνώση της σύνθεσης έχει αποκτηθεί με τη χρήση τεχνικών που αναλύουν τη μαζική σύνθεση πολλαπλών EVs και επιπλέον, συχνά δεν έχει δοθεί επαρκής προσοχή στους κρίσιμους συγχυτικούς παράγοντες, καθώς δεν έχουν ακόμη αναγνωριστεί όλοι. Ορισμένες τεχνικές παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τη συνολική βιοχημική σύνθεση σε επίπεδο μεμονωμένων EV, όπως η φασματοσκοπία Raman (Enciso-Martinez et al., 2020), αλλά οι τεχνικές αυτές βρίσκονται σε νηπιακό στάδιο όσον αφορά τις αναλύσεις EV και απαιτείται περισσότερη έρευνα για τον προσδιορισμό του πραγματικού συνδυασμού και της στοιχειομετρίας των μορίων που σχηματίζουν ένα κυστίδιο. Επίσης, οι τρέχουσες τεχνικές επιτρέπουν ανεπαρκώς την ανάλυση των χρονοεξαρτώμενων μεταβολών στους πληθυσμούς EV.

Συνολικά, είναι σαφές ότι οι φυσικές ιδιότητες των EVs προκαλούν προκλήσεις για την (οπτική) ανίχνευση και απομόνωση, αλλά έχουμε φτάσει σε ένα σημείο όπου οι τεχνολογικές καινοτομίες στην ανίχνευση και την απομόνωση των EVs, σε συνδυασμό με τις προσπάθειες τυποποίησης και την έγκυρη υποβολή εκθέσεων, θα βελτιώσουν την αναπαραγωγιμότητα σε τέτοιο βαθμό ώστε σύντομα να καταστούν δυνατές οι πολυκεντρικές μελέτες (Nieuwland et al., 2020).

-#- 2.2. Πολυπλοκότητα των υγρών που περιέχουν εξωκυτταρικά κυστίδια

Συχνά, τα EVs είναι παρόντα σε σύνθετα (σωματικά) υγρά με υψηλές συγκεντρώσεις κυττάρων, σωματιδίων που δεν είναι EVs και διαλυτών πρωτεϊνών. Συνήθως, τα EVs διαχωρίζονται από τα κύτταρα με διαφορική φυγοκέντρηση. Υπάρχει τουλάχιστον μία πρόκληση, και αυτή είναι ο διαχωρισμός των EVs από τα αιμοπετάλια στο πλάσμα αίματος. Επειδή τα αιμοπετάλια είναι μικρά κύτταρα (2-4 μm), στερούνται πυρήνα και έχουν πυκνότητα κοντά στα EVs, είναι δύσκολο να διαχωριστούν τα αιμοπετάλια από τα EVs με φυγοκέντρηση (Rikkert et al., 2018). Κατά συνέπεια, το πλάσμα “χωρίς αιμοπετάλια” θα εξακολουθεί να περιέχει αιμοπετάλια ((Rikkert et al., 2021).). Οι διαλυτές πρωτεΐνες παρουσιάζουν μικρότερο πρόβλημα, επειδή ο κύριος όγκος των πρωτεϊνών μπορεί να διαχωριστεί από τα EVs με διαφορική υπερφυγοκέντρηση σε συνδυασμό με πλύσεις ή με χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (Böing et al., 2014). Ωστόσο, η παρουσία σωματιδίων που δεν ανήκουν στα EV, συμπεριλαμβανομένων των λιποπρωτεϊνών (πλάσμα), των συσσωματωμάτων πρωτεϊνών και ακόμη και των ιών, προκαλεί περισσότερα προβλήματα, καθώς μπορεί να επικαλύπτονται σε μέγεθος και πυκνότητα με τα EVs (Zhang et al., 2020). Αυτό απεικονίζεται στην Εικ. 2, όπου φαίνεται η παρουσία λίγων EVs σε πλήθος λιποπρωτεϊνών. Παρομοίως, το μέσο κλιματιζόμενης καλλιέργειας συχνά περιέχει EVs, λιποπρωτεΐνες (συμπεριλαμβανομένων των χυλομικρών) και διαλυτές πρωτεΐνες από τον ορό που χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια των κυττάρων (Zhang et al., 2020), ενώ το γάλα περιέχει όχι μόνο EVs αλλά και σωματίδια καζεΐνης, σφαιρίδια λίπους γάλακτος και ενδεχομένως λιποπρωτεΐνες που συνδιαλύονται με EVs (Hu et al., 2021). Συνεπώς, η παρουσία σωματιδίων μη EV μπορεί να παρεμποδίσει τον διαχωρισμό και τον χαρακτηρισμό των EVs.

-#- 2.4. Απομόνωση, ανίχνευση, ανάλυση και αναφορά δεδομένων

Μετά τη συλλογή υγρών που περιέχουν EV, οι περισσότερες μέθοδοι που ακολουθούν απαιτούν απομόνωση των EV πριν από την ανάλυση, για παράδειγμα για τη διεξαγωγή πρωτεωμικής ή λιπιδομικής. Η επιλογή της μεθόδου απομόνωσης εξαρτάται από το υπό μελέτη υγρό που περιέχει EV (σώμα), την ανάλυση που ακολουθεί, το κατά πόσον η παρουσία συγκεκριμένων συγχυτικών παραγόντων ή αντιδραστηρίων (π.χ. αντιπηκτικών που προστίθενται στο αίμα για την πρόληψη της πήξης) μπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσματα της ανάλυσης που ακολουθεί, καθώς και την τελική εφαρμογή, η οποία μπορεί να κυμαίνεται από βασικές ερευνητικές αναλύσεις έως διαγνωστικές εξετάσεις ρουτίνας. Όπως εξηγήθηκε στις προηγούμενες ενότητες, οι φυσικές ιδιότητες των EV και η πολυπλοκότητα των υγρών που περιέχουν EV αποτελούν προκλήσεις για την απομόνωση EV. Κατ’ αρχήν, οι διαθέσιμες σήμερα μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση των EVs διαχωρίζουν τα σωματίδια ουσιαστικά είτε με βάση το μέγεθος, το φορτίο, την πυκνότητα ή τη βιοχημική σύνθεση. Ως γενικός κανόνας, μπορεί κανείς να δηλώσει ότι όταν τα EVs απομονώνονται με μία μέθοδο, δηλαδή με μία μέθοδο που απομονώνει τα EVs με βάση το μέγεθος, το φορτίο, την πυκνότητα ή τη βιοχημική σύνθεση, τα απομονωμένα EVs είναι πιθανό να είναι ακάθαρτα και να περιέχουν συγχυτικούς παράγοντες. Ως εκ τούτου, διερευνώνται τώρα συνδυασμοί μεθόδων διαχωρισμού. Για παράδειγμα, τα EVs του πλάσματος μπορούν να καθαριστούν με διαχωρισμό με βάση το μέγεθος και στη συνέχεια με διαχωρισμό με βάση την πυκνότητα. Στο πρώτο βήμα, τα EVs διαχωρίζονται από τις διαλυτές πρωτεΐνες και τις μικρές λιποπρωτεΐνες, όπως η HDL, με χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους και στο δεύτερο βήμα τα EVs διαχωρίζονται από τα χυλομικρά και τις LDL (μεγαλύτερα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια) με φυγοκέντρηση διαβάθμισης πυκνότητας (Karimi et al., 2018)”.

“Όπως εξηγήθηκε, υπάρχουν πολλές γνωστές και πιθανώς ακόμη περισσότερες άγνωστες μεταβλητές που μπορεί να επηρεάσουν τα αποτελέσματα της μέτρησης των EV. Εφόσον δεν γνωρίζουμε όλες τις μεταβλητές και διαθέτουμε περιορισμένα εργαλεία για την αξιολόγηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιδράσεων αυτών των μεταβλητών με αναπαραγώγιμο τρόπο, η λεπτομερής αναφορά των χαρακτηριστικών του συλλεγόμενου βιοδείγματος και των εφαρμοζόμενων προ-αναλυτικών διαδικασιών παραμένει σημαντική.”

-#- 3.5. Προς την τυποποίηση

“Η μετρολογία είναι η επιστήμη των μετρήσεων και των εφαρμογών τους και περιλαμβάνει την ανιχνεύσιμη ακρίβεια, την ακρίβεια και την επαναληψιμότητα μιας μέτρησης, συχνά με τη βοήθεια ενός “προτύπου”, για να βοηθήσει την ερμηνεία των δεδομένων και τη σύγκριση μεταξύ διαφορετικών συστημάτων μέτρησης. Αν και τα βιολογικά συστήματα είναι δύσκολο, αν όχι αδύνατο, να τυποποιηθούν, οι αρχές της μετρολογίας διερευνώνται τώρα στον τομέα της ΕΒ, ώστε να ανοίξει ο δρόμος για την αναπαραγωγιμότητα”.

-#- 4. Περίληψη

“Στο πρώτο μέρος συνοψίσαμε τις προκλήσεις της μελέτης των EVs και στο επόμενο μέρος πώς ο τομέας κινείται ενεργά προς την κατεύθυνση των ανιχνεύσιμων και αναπαραγώγιμων μετρήσεων μέσω μιας υποδομής που έχει δημιουργηθεί από την κοινότητα. Η βαθμονόμηση των οργάνων αναμένεται να ανοίξει το δρόμο προς την παρακολούθηση πιθανών διακυμάνσεων που προκαλούνται από το βιοδείγμα και τις προ-αναλυτικές διαδικασίες, τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας των διαδικασιών απομόνωσης, την εκτέλεση πολυκεντρικών μελετών και, τέλος, τον καθορισμό σειρών αναφοράς των ειδικών για τον κυτταρικό τύπο EVs σε σωματικά υγρά για κλινική χρήση. Επιπλέον, με την έναρξη της υποεπιτροπής αυστηρότητας και τυποποίησης και την προώθηση των δραστηριοτήτων της ομάδας εργασίας, της εκπαίδευσης και της διαφανούς αναφοράς, υπάρχει ήδη αποδεδειγμένη και αυξανόμενη ευαισθητοποίηση των ερευνητών EV σχετικά με τη σημασία της παραγωγής και αναφοράς ιχνηλάσιμων και αναπαραγώγιμων αποτελεσμάτων (Nieuwland et al., 2020). Είναι σημαντικό ότι η αναπτυχθείσα υποδομή μπορεί να τοποθετήσει την έρευνα EV σε μια θέση πόλου στον τομέα της (βιο)ιατρικής έρευνας με την παραγωγή αξιόπιστων και αναπαραγώγιμων δεδομένων, τα οποία με τη σειρά τους μπορούν να συμβάλουν στην υπέρβαση των προβλημάτων αναπαραγωγιμότητας στην επιστήμη.”

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0171933522000292?via%3Dihub

–> Σύνοψη:

  • Ειδικά ζητήματα προκύπτουν κατά την εργασία με αυτές τις οντότητες, το μέγεθος και η ποσότητα των οποίων συχνά καθιστούν δύσκολη την απόκτησή τους ως σχετικά καθαρά παρασκευάσματα και τον κατάλληλο χαρακτηρισμό τους
  • Ένα σημαντικό σημείο που πρέπει να ληφθεί υπόψη είναι ότι η απόδοση μιας συγκεκριμένης λειτουργίας σε EVs γενικά ή σε υποτύπους EVs απαιτεί την αναφορά συγκεκριμένων πληροφοριών πέρα από την απλή περιγραφή της λειτουργίας σε ένα ακατέργαστο, δυνητικά μολυσμένο και ετερογενές παρασκεύασμα
  • Οι ισχυρισμοί ότι τα εξωσώματα είναι προικισμένα με εξαιρετικές και ειδικές δραστηριότητες παραμένουν δύσκολο να υποστηριχθούν πειραματικά, δεδομένης της ακόμη περιορισμένης γνώσης των συγκεκριμένων μοριακών μηχανισμών βιογένεσης και απελευθέρωσής τους, σε σύγκριση με άλλα βιοφυσικά παρόμοια EVs.
  • Το 2014, τα μέλη του διοικητικού συμβουλίου του ISEV δημοσίευσαν ένα Position Editorial στο οποίο περιγράφουν λεπτομερώς τις συστάσεις τους, με βάση τη δική τους καθιερωμένη τεχνογνωσία, σχετικά με τις “ελάχιστες πειραματικές απαιτήσεις για τον ορισμό των εξωκυττάριων κυστιδίων και των λειτουργιών τους”
  • Το διοικητικό συμβούλιο του ISEV υπογράμμισε την ανάγκη να λαμβάνονται υπόψη αυτά τα ζητήματα όταν διατυπώνονται ισχυρά συμπεράσματα σχετικά με τη συμμετοχή των EVs ή συγκεκριμένων πληθυσμών EVs (ιδίως των εξωσωμάτων) σε οποιαδήποτε φυσιολογική ή παθολογική κατάσταση ή όταν προτείνονται τα EVs ή το μοριακό φορτίο τους ως βιολογικοί δείκτες
  • Η ISEV εξακολουθούσε να ανησυχεί για το γεγονός ότι τα σημαντικά συμπεράσματα σε ορισμένα άρθρα δεν υποστηρίζονται επαρκώς από τα πειράματα που εκτελούνται ή τις πληροφορίες που αναφέρονται
  • Σε αυτή την επικαιροποίηση “MISEV2018”, μια πολύ μεγαλύτερη ομάδα επιστημόνων του ISEV συμμετείχε μέσω μιας κοινοτικής προσέγγισης (η έρευναMISEV2018 Survey), προσπαθώντας να επιτύχει συναίνεση σχετικά με το τι είναι απολύτως απαραίτητο, τι πρέπει να γίνει εάν είναι δυνατόν και πώς να ερμηνεύονται με προσοχή τα αποτελέσματα εάν δεν μπορούν να ακολουθηθούν όλες οι συστάσεις για τους ελέγχους
  • Τα EVs φαίνεται να παράγονται σχεδόν από όλους τους οργανισμούς και τους κυτταρικούς τύπους που μελετήθηκαν
  • Η έρευνα για τα EVs μέχρι σήμερα έχει επικεντρωθεί σε EVs θηλαστικών, κυρίως αυτά που προέρχονται από τον άνθρωπο ή τα ποντίκια, και δεν έχουν διερευνηθεί διεξοδικά όλοι οι τύποι κυττάρων ή οι πειραματικές συνθήκες
  • Οι γενικές αρχές του MISEV2018 ισχύουν για τα EV που παράγονται από όλους τους οργανισμούς και όλα τα κύτταρα.
  • Η ανάγκη απόδειξης της παρουσίας (ή του εμπλουτισμού) δεικτών EV και της απουσίας (ή της εξάντλησης) υποτιθέμενων προσμίξεων, όταν περιγράφεται το περιεχόμενο ή η λειτουργία των EVs, μπορεί να γενικευτεί σε όλα τα είδη, τα κύτταρα και τις συνθήκες
  • Με άλλα λόγια, αν κάποιος ισχυριστεί ότι κάτι είναι εξώσωμα και προχωρήσει στην περιγραφή του περιεχομένου και των λειτουργιών του, πρέπει να υπάρχει απουσία προσμίξεων (δηλαδή πρέπει να είναι καθαρισμένο και απομονωμένο).
  • Δεδομένου ότι δεν έχει ακόμη προκύψει συναίνεση σχετικά με συγκεκριμένους δείκτες των υποτύπων EV, όπως τα “εξωσώματα” που προέρχονται από το ενδοσωμάτιο και τα “εκτοσώματα” (μικροσωματίδια/μικροκυψελίδες) που προέρχονται από την πλασματική μεμβράνη, η απόδοση ενός EV σε μια συγκεκριμένη οδό βιογένεσης παραμένει εξαιρετικά δύσκολη, εκτός εάν, π.χ., το EV συλλαμβάνεται εν τη γενέσει της απελευθέρωσης με τεχνικές ζωντανής απεικόνισης
  • Οι συγγραφείς προτρέπονται να εξετάσουν τη χρήση επιχειρησιακών όρων για τους υποτύπους EV που αναφέρονται σε φυσικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των EVs στη θέση όρων όπως εξώσωμα και μικροσωματίδιο που ιστορικά επιβαρύνονται τόσο από πολλαπλούς, αντιφατικούς ορισμούς όσο και από ανακριβείς προσδοκίες μοναδικής βιογένεσης.
  • Το πρώτο βήμα για την ανάκτηση των EVs είναι η συγκομιδή μιας μήτρας που περιέχει EV, όπως υγρό από καλλιέργεια ιστού ή από ένα διαμέρισμα του οργανισμού
  • Ένας εκτεταμένος αστερισμός παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την ανάκτηση των EV, όπως
  1. Χαρακτηριστικά της πηγής
  2. τον τρόπο χειρισμού και αποθήκευσης του υλικού της πηγής
  3. Πειραματικές συνθήκες
  • Μια έρευνα του ISEV διαπίστωσε ότι η πλειοψηφία των ερευνητών που απάντησαν σε έρευνα για τα ηλεκτρικά ρεύματα μελετούσε εξαρτημένο μέσο
  • Ιδιαίτερα σημαντικό για τις μελέτες EV είναι ότι πρέπει να αναφέρεται το ποσοστό των νεκρών κυττάρων κατά τη στιγμή της συλλογής EV, δεδομένου ότι ακόμη και ένα μικρό ποσοστό κυτταρικού θανάτου θα μπορούσε να απελευθερώσει κυτταρικές μεμβράνες που ξεπερνούν τα πραγματικά απελευθερωμένα EV
  • Ο ποσοτικός προσδιορισμός του ποσοστού των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων μπορεί επίσης να είναι χρήσιμος
  • Όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με υψηλές συγκεντρώσεις EVs, τα EVs που προσκολλώνται στα κύτταρα και είναι θετικά για αποπτωτικούς δείκτες μπορεί να αλλοιώσουν τα αποτελέσματα.
  • Με άλλα λόγια, είναι σημαντικό να προσέξουμε για αποπτωτικά και νεκρωτικά κύτταρα σε ένα δείγμα, καθώς ο κυτταρικός θάνατος μπορεί να απελευθερώσει πολυάριθμες μεμβράνες, συμπεριλαμβανομένων EV με αποπτωτικούς “δείκτες”… αλλά ας το αγνοήσουμε αυτό και ας συνεχίσουμε να προσποιούμαστε ότι τα σωματίδια είναι όλα διαφορετικά…
  • Σημειώστε ότι η ανάκτηση EV δεν εξαρτάται μόνο από την απελευθέρωση EV, αλλά και από την επαναπρόσληψη από τα κύτταρα στην καλλιέργεια, η οποία μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με την πυκνότητα της καλλιέργειας και άλλες συνθήκες
  • Απαιτούνται τακτικοί έλεγχοι για μόλυνση με μυκόπλασμα (και ενδεχομένως άλλα μικρόβια), όχι μόνο λόγω των κυτταρικών αντιδράσεων στη μόλυνση, αλλά και επειδή τα μολυσματικά είδη μπορούν να απελευθερώσουν EVs
  • Όλες οι λεπτομέρειες σχετικά με τη σύνθεση και την προετοιμασία του μέσου καλλιέργειας πρέπει να παρέχονται στις μεθόδους
  • Αυτό θα πρέπει να είναι σύνηθες για μελέτες κυτταροκαλλιέργειας και είναι διπλά σημαντικό εδώ, καθώς συμπληρώματα όπως η γλυκόζη, τα αντιβιοτικά και οι αυξητικοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν την παραγωγή και/ή τη σύνθεση των EV.
  • Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στα συστατικά του μέσου που είναι πιθανό να περιέχουν EVs, όπως οι εμβρυϊκοί οροί βοοειδών και άλλοι οροί.
  • Τα EVs λαμβάνονται ιδανικά από μέσο καλλιέργειας που έχει υποστεί κλιμάκωση από κύτταρα απουσία εμβρυϊκού ορού μοσχαριού (FCS ή FBS), ορού από άλλα είδη ή άλλων σύνθετων προϊόντων, όπως το λύσμα αιμοπεταλίων, το εκχύλισμα υπόφυσης, τα χολικά άλατα και άλλα, ώστε να αποφεύγεται η συναπομόνωση εξωγενών EVs
  • Λάβετε υπόψη σας αυτή τη συναπομόνωση των εξωγενών (δηλαδή εκτός του σώματος) και για μελέτες ιολογίας που χρησιμοποιούν FBS.
  • Στην περίπτωση της εξάντλησης, η στέρηση θρεπτικών συστατικών ή EVs από κύτταρα που κανονικά καλλιεργούνται σε μέσο που περιέχει ορό ή λυσάτη μπορεί να αλλάξει την κυτταρική συμπεριφορά και τη φύση και τη σύνθεση των απελευθερούμενων EVs
  • Εναλλακτικά, τα κύτταρα μπορούν να εκτεθούν κατά τη διάρκεια της περιόδου απελευθέρωσης EV σε μέσο που έχει προηγουμένως απομειωθεί από EVs και οι επιπτώσεις στα κύτταρα και τα EVs είναι αναμενόμενες και οι μέθοδοι και τα αποτελέσματα της απομείωσης ποικίλλουν σε μεγάλο βαθμό και θα πρέπει να αναφέρονται
  • Η θερμική αδρανοποίηση πρόσθετων ουσιών, όπως ο ορός, οδηγεί σε σχηματισμό πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων που μπορεί να συν-κατακρημνιστούν με τα EVs και έτσι να αλλάξουν επίσης τις ιδιότητες του ορού που υποστηρίζουν την ανάπτυξη.
  • Κάθε βιολογικό υγρό παρουσιάζει συγκεκριμένα βιοφυσικά και χημικά χαρακτηριστικά που το καθιστούν διαφορετικό από το μέσο καλλιέργειας και αυτό πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά την απομόνωση των EVs
  • Για παράδειγμα, το πλάσμα και ο ορός είναι πιο παχύρρευστα από το κλιματιζόμενο μέσο και περιέχουν πολυάριθμες λιπιδικές δομές που δεν είναι EVs (λιποπρωτεΐνες χαμηλής/πολύ χαμηλής/υψηλής πυκνότητας), το γάλα είναι γεμάτο με κυστίδια που περιέχουν λίπος, τα ούρα έχουν ουρομοντουλίνη (πρωτεΐνη Tamm-Horsfall), το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα με επιφανειοδραστικό παράγοντα, τα οποία όλα θα συν-απομονωθούν σε διάφορους βαθμούς με EVs
  • Σε κάθε περίπτωση, μπορεί να απαιτούνται ειδικές προφυλάξεις για το διαχωρισμό των EVs από αυτά τα συστατικά (γιατί να μην απαιτούνται;)
  • Ενώ οι λεπτομερείς κατευθυντήριες γραμμές για την αναφορά συγκεκριμένων βιορευστών ξεφεύγουν από το πεδίο εφαρμογής του παρόντος MISEV, ενθαρρύνεται η ανάπτυξη τέτοιων κατευθυντήριων γραμμών υπό την ομπρέλα του MISEV.
  • Να δοθούν παραδείγματα εκτιμήσεων για παράγωγα του αίματος, όπως το πλάσμα, τα οποία μπορεί να επηρεάσουν τα κυκλοφορούντα EVs:
  1. Ηλικία του δότη
  2. Βιολογικό φύλο
  3. Τρέχουσα ή προηγούμενη εγκυμοσύνη
  4. Εμμηνόπαυση
  5. Προ/μεταγευματική κατάσταση (νηστεία/μη νηστεία)
  6. Ώρα της ημέρας συλλογής (κιρκαδιανές διακυμάνσεις)
  7. Επίπεδο άσκησης και χρόνος τελευταίας άσκησης
  8. Διατροφή
  9. Δείκτης μάζας σώματος
  10. Ειδικά λοιμώδη και μη λοιμώδη νοσήματα
  11. Φάρμακα
  12. Άλλοι παράγοντες
  • Εκτός από όλα αυτά, τίποτα δεν επηρεάζει τη λήψη EV από το πλάσμα…
  • Ειδικά για την εξαγωγή EV από ιστούς, είναι δύσκολο να διασφαλιστεί ότι τα ανακτώμενα κυστίδια προέρχονται πραγματικά από τον εξωκυττάριο χώρο και δεν είναι ενδοκυττάρια κυστίδια ή τεχνητά σωματίδια που απελευθερώνονται από κύτταρα που έχουν σπάσει κατά τη διάρκεια της συλλογής, της επεξεργασίας (π.χ. μηχανική διάσπαση) ή της αποθήκευσης (συμπεριλαμβανομένης της κατάψυξης)
  • Ακόμη και τα φαινομενικά καθαρά EVs που προέρχονται από ιστούς μπορεί να περιέχουν συστατικά ενδοσωμάτων, τα οποία θα μπορούσαν να αντιστοιχούν σε συστατικά ενδοκυτταρικών κυστιδίων, συμπεριλαμβανομένων των μη απελευθερωμένων ενδοσωματικών κυστιδίων των όψιμων ενδοσωμάτων/πολυκυτταρικών σωμάτων (MVBs) που απελευθερώνονται τεχνητά κατά την επεξεργασία των ιστών
  • Η πρόσφατη συνειδητοποίηση αυτών των προκλήσεων έχει οδηγήσει τους ερευνητές στην εκτέλεση ήπιας ιστικής διάσπασης (δηλαδή με στόχο το διαχωρισμό των EVs από τα κύτταρα και την εξωκυττάρια μήτρα, αλλά χωρίς να διαταράσσονται τα κύτταρα) και σε διάφορα στάδια περαιτέρω διαχωρισμού (συμπεριλαμβανομένων των βαθμίδων πυκνότητας), ακολουθούμενα από αυστηρό χαρακτηρισμό πολλαπλών αρνητικών δεικτών, οδηγώντας σε πιο πειστικά παρασκευάσματα EV που προέρχονται από ιστούς
  • Απαιτείται σαφώς περισσότερη έρευνα και ενθαρρύνεται η απομόνωση, ο χαρακτηρισμός και η λειτουργία των EVs των ιστών.
  • Ο απόλυτος καθαρισμός ή η πλήρης απομόνωση των EVs από άλλες οντότητες είναι ένας μη ρεαλιστικός στόχος.
  • Ο διαχωρισμός (που στην καθομιλουμένη αναφέρεται ως καθαρισμός ή απομόνωση) 1) των EVs από άλλα μη EV συστατικά της μήτρας (κλιματιζόμενο μέσο, βιορευστό, ιστός) και 2) των διαφόρων τύπων EVs μεταξύ τους, επιτυγχάνεται σε διάφορους βαθμούς με τις διάφορες διαθέσιμες τεχνικές.
  • Η συγκέντρωση είναι ένα μέσο για την αύξηση του αριθμού των EVs ανά μονάδα όγκου, με ή χωρίς διαχωρισμό
  • Η απάντηση για το πόσο καθαρό πρέπει να είναι ένα παρασκεύασμα EV εξαρτάται από το πειραματικό ερώτημα και την τελική χρήση των EV και συχνά διαχωρίζεται κατά βασική και κλινική έρευνα
  • Χρειάζονται πολύ καθαρισμένα EVs για να αποδοθεί μια λειτουργία ή ένας βιοδείκτης στα κυστίδια σε σύγκριση με άλλα σωματίδια
  • Λιγότερο καθαρά EVs μπορεί να απαιτούνται σε άλλες περιπτώσεις, όπως όταν ένας βιοδείκτης είναι χρήσιμος χωρίς προ-εμπλουτισμό των EVs, ή σε ορισμένες θεραπευτικές καταστάσεις όπου προέχει η λειτουργία και όχι η οριστική συσχέτιση της λειτουργίας με τα EVs
  • Σημειωτέον, ορισμένοι υποτιθέμενοι μολυσματικοί παράγοντες μπορεί να συν-απομονώνονται με τα EVs και να συμβάλλουν ακόμη και στη λειτουργία των EVs
  • Στα τέλη του 2015, σύμφωνα με μια παγκόσμια έρευνα ISEV [6], η διαφορική υπερφυγοκέντρηση ήταν η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη πρωτογενής τεχνική διαχωρισμού και συγκέντρωσης EV
  • Έχουν αναπτυχθεί ή αναπτύσσονται επί του παρόντος διάφορες πρόσθετες τεχνικές ή συνδυασμοί τεχνικών, ορισμένες από τις οποίες ενδέχεται να αποκτήσουν μεγαλύτερη σημασία τα επόμενα χρόνια, εάν επιτύχουν καλύτερη ανάκτηση ή ειδικότητα από τις παλαιότερες μεθόδους
  • Ο Hendrix και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι μόνο τα μισά περίπου άρθρα σχετικά με τα EV που δημοσιεύθηκαν σε διάστημα πέντε ετών περιλάμβαναν θετικούς δείκτες των EV, και μόνο μια μικρή μειοψηφία συμπλήρωνε τους θετικούς με αρνητικούς δείκτες για την ανίχνευση συν-απομονωμένων συστατικών μη EV
  • Η ποσοτικοποίηση των ίδιων των EVs παραμένει δύσκολη
  • Τα EVs λέγεται ότι έχουν σωματιδιακή δομή και περιέχουν:

° Πρωτεΐνες

° Λιπίδια

° Νουκλεϊκά οξέα

° Άλλα βιομόρια

  • Ο ποσοτικός προσδιορισμός καθενός από αυτά τα συστατικά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατο (δηλαδή αναπληρωματικό) για τον ποσοτικό προσδιορισμό των EVs, αλλά καμία από αυτές τις τιμές δεν συσχετίζεται απαραίτητα απόλυτα με τον αριθμό των EVs.
  • Ο αριθμός των σωματιδίων μπορεί να μετρηθεί με τεχνολογίες σκέδασης φωτός, ωστόσο ο ακριβής ποσοτικός προσδιορισμός μπορεί να είναι δυνατός μόνο εντός ενός συγκεκριμένου εύρους συγκεντρώσεων και μεγεθών που ποικίλλει ανάλογα με την πλατφόρμα
  • Η καταμέτρηση σωματιδίων με τεχνικές σκέδασης φωτός, RPS και παρόμοιες τεχνικές οδηγεί συνήθως σε υπερεκτίμηση του αριθμού των EV, δεδομένου ότι οι τεχνικές δεν είναι ειδικές για τα EV και καταγράφουν επίσης συν-ομοιογενή σωματίδια, συμπεριλαμβανομένων των λιποπρωτεϊνών και των συσσωματωμάτων πρωτεϊνών
  • Ενδεχομένως, η συνεχιζόμενη ανάπτυξη των δυνατοτήτων φθορισμού των συσκευών NTA μπορεί τελικά να επιτρέψει τη μέτρηση ειδικά για τα EV, αν και η ευαισθησία της ανάλυσης και η τάση των αντισωμάτων σήμανσης και των λιπιδικών χρωστικών να σχηματίζουν σωματίδια θέτουν σημαντικά εμπόδια σε τέτοιες εφαρμογές.
  • Το ιδιόκτητο λογισμικό που χρησιμοποιείται για την ανάλυση των δεδομένων από κάθε συσκευή μπορεί να εφαρμόζει άγνωστη επιλογή και άλλη επεξεργασία των δεδομένων, με αποτέλεσμα διαφορές στις απόλυτες τιμές που λαμβάνονται από διαφορετικά λογισμικά ή διαφορετικές εκδόσεις του ίδιου λογισμικού.
  • Ο ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών μπορεί να οδηγήσει σε υπερεκτίμηση εξαιτίας συν-απομονωμένων πρωτεϊνικών προσμίξεων (όπως η λευκωματίνη από το μέσο καλλιέργειας ή το πλάσμα/ορό), ιδίως όταν χρησιμοποιούνται οι λιγότερο ειδικές μέθοδοι διαχωρισμού EV, ή αντίθετα μπορεί να αποδειχθεί ότι δεν είναι αρκετά ευαίσθητες εάν οι πολύ ειδικές μέθοδοι δίνουν καθαρά EV
  • Τα αποτελέσματα μπορεί να διαφέρουν ανάλογα με τη χρήση ή μη απορρυπαντικού για τη διάσπαση των EVs και την έκθεση ολόκληρου του πρωτεϊνικού περιεχομένου πριν από τη διεξαγωγή της ανάλυσης.
  • Ο ποσοτικός προσδιορισμός των ολικών λιπιδίων απαιτεί εξειδικευμένο εξοπλισμό και οι δύο πρώτοι τύποι δοκιμών ενδέχεται να μην είναι επαρκώς ευαίσθητοι για μικρές ποσότητες EVs
  • Επιπλέον, πρέπει ακόμη να διαπιστωθεί κατά πόσον οι τεχνικές αυτές ανιχνεύουν εξίσου όλα τα EVs ανεξάρτητα από την ειδική σύνθεση των λιπιδίων τους
  • Η ποσοτικοποίηση του ολικού RNA είναι δύσκολο να συστηθεί προς το παρόν για ποσοτικοποίηση EV ή αναλύσεις καθαρότητας, δεδομένου ότι τα exRNAs συνδέονται σε αφθονία με άλλες κυκλοφορούσες και δυνητικά συνδιαχωριζόμενες οντότητες: κυρίως ριβονουκλεοπρωτεΐνες, αλλά και μια σειρά σωματιδίων, συμπεριλαμβανομένων των εξωμερών και των λιποπρωτεϊνών
  • Οι αναλογίες των διαφόρων μεθόδων ποσοτικού προσδιορισμού μπορούν να παρέχουν χρήσιμα μέτρα καθαρότητας
  • Για παράδειγμα, ο λόγος πρωτεΐνη: σωματίδιο, ο λόγος πρωτεΐνη: λιπίδια και ο λόγος RNA: σωματίδιο έχουν προταθεί ως πιθανές μετρικές καθαρότητας, αν και η εφαρμογή τους σε όλες τις μεθόδους ποσοτικοποίησης πρωτεϊνών, λιπιδίων, RNA και σωματιδίων μένει να καθοριστεί.
  • Οι μέθοδοι απόλυτης διαστασιολόγησης και καταμέτρησης των EV είναι επί του παρόντος ατελείς και θα χρειαστούν περαιτέρω βελτίωση.
  • Δεδομένου ότι οι μελέτες σχετικά με την επιλογή πρωτεϊνών για χρήση ως δεικτών EV πραγματοποιήθηκαν με διαφορετικές προσεγγίσεις διαχωρισμού και με διαφορετικές κυτταρικές πηγές EVs, δεν είναι ακόμη δυνατό να προταθούν ειδικοί και καθολικοί δείκτες του ενός ή του άλλου τύπου EVs, πόσο μάλλον των “εξωσωμάτων” που προέρχονται από MVB σε σύγκριση με άλλα μικρά EVs.
  • Η MISEV2018 δεν προτείνει μοριακούς δείκτες που θα μπορούσαν να χαρακτηρίσουν ειδικά κάθε υποτύπο EV
  • Σε αυτή την επικαιροποιημένη έκδοση, MISEV2018, η αναφορά στα εξωσώματα και στις πρωτεΐνες που αναμένονται ή δεν αναμένονται σε αυτά (οι προηγουμένως αποκαλούμενοι “αρνητικοί έλεγχοι” των παρασκευασμάτων “εξωσωμάτων”) έχουν διαγραφεί, αντανακλώντας την εξελισσόμενη κατανόηση των υποτύπων των EVs και τις συσχετίσεις τους με άλλες οντότητες
  • Κατά τον προσδιορισμό της τοπολογίας των συστατικών που συνδέονται με τα EV, η τοπολογία του αυλού έναντι της επιφάνειας των διαφόρων συστατικών που συνδέονται με τα EV, συμπεριλαμβανομένων των νουκλεϊκών οξέων, των πρωτεϊνών, των γλυκανών κ.λπ. δεν είναι απολύτως αυστηρά καθορισμένη
  • Θεωρητικά, τα συστατικά που εντοπίζονται στο κυτταρόλυμα των κυττάρων που εκκρίνουν EV θα πρέπει να βρίσκονται στο εσωτερικό των EV και, ως εκ τούτου, να προστατεύονται από την ήπια αποικοδόμηση από πρωτεάσες ή νουκλεάσες
  • Ενώ αυτή η προστασία παρατηρείται συνήθως, σε ορισμένες μελέτες βρέθηκαν απροσδόκητα πρωτεΐνες, RNA και DNA στην επιφάνεια των EV και ευαίσθητα στην πέψη
  • Δεν είναι ακόμη σαφές αν αυτή η απροσδόκητη τοπολογία οφείλεται σε υπολείμματα από νεκρά ή ετοιμοθάνατα κύτταρα ή είναι αντίθετα το αποτέλεσμα άγνωστων ακόμη μηχανισμών μεταφοράς ενδοκυττάριων διαμερισμάτων διαμέσου μεμβρανών που θα μπορούσαν να συμβούν σε ορισμένες φυσιολογικές ή παθολογικές καταστάσεις.
  • Ακόμη και ένας μικρός βαθμός μόλυνσης με ενδοκυτταρικό υλικό (με την αντίστροφη τοπολογία σε σχέση με τα EVs) θα περιέπλεκε την ερμηνεία.
  • Οι στόχοι αυτών των συστάσεων του 2018 για τη μελέτη των λειτουργιών των EVs είναι να αποφευχθούν οι υπερβολικές ερμηνείες ή τα κλασικά τεχνάσματα κατά την ανάλυση των λειτουργιών των EVs
  • Η απόδειξη ότι μια λειτουργία είναι ειδική για τα εξωσώματα (EVs ενδοσωματικής προέλευσης), σε σύγκριση με άλλους τύπους μικρών EVs, δεν συνιστάται ως κύριο σημείο οποιασδήποτε μελέτης EVs
  • Η ανίχνευση εντός του κυττάρου σήματος από μια χρωστική σήμανσης EV ή άλλη οντότητα δεν σημαίνει απαραίτητα ότι το EV ή το φορτίο του έχει εσωτερικευθεί
  • Ορισμένες ουσίες σήμανσης είναι πολύ μακράς διάρκειας ζωής, μπορούν να υπάρχουν χωριστά από την πιθανώς επισημασμένη οντότητα και μπορούν να σχηματίσουν σωματίδια που μιμούνται τα EV και είναι δύσκολο να διαχωριστούν από τα EVs
  • Ένα άλλο πιθανό τεχνούργημα είναι ότι η επισήμανση των EVs με λιπόφιλες ή επιφανειακές φθοροφόρες μπορεί να τροποποιήσει τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των EVs, μεταβάλλοντας έτσι τον τρόπο ανίχνευσης και/ή την πρόσληψη από τα κύτταρα-στόχους
  • Πρέπει να αποδειχθεί ότι η δραστηριότητα συνδέεται κυρίως με τα EVs και όχι με διαλυτούς μεσολαβητές

° Συνήθως, μια δραστηριότητα που σχετίζεται με EV διερευνάται με:

  1. Διαχωρισμό και συγκέντρωση EVs από βιορευστό ή μέσο κυτταροκαλλιέργειας.
  2. Εφαρμογή EVs σε κύτταρο ή οργανισμό-δέκτη
  3. Παρατήρηση φαινοτύπου ανάγνωσης

° Ωστόσο, για να υποστηριχθεί πειστικά ότι μια ανιχνευόμενη ανάγνωση/λειτουργία είναι EV-γενής, πρέπει να προσδιοριστεί ότι η δραστηριότητα είναι ειδικά εμπλουτισμένη στα EV (ενδεχομένως με συστατικά που δεν ανήκουν στα EV) και όχι λόγω χαμηλών ποσοτήτων ενός εξαιρετικά ενεργού διαλυτού μορίου που παραμένει μη ειδικά στο παρασκεύασμα EV.

  • Πρέπει να αποδειχθεί ότι η ειδική συσχέτιση της δραστηριότητας είναι με EVs και όχι με συν-απομονωμένα συστατικά:

° Ειδικά όταν πρόκειται για συμπυκνωμένα παρασκευάσματα εμπλουτισμένα σε μικρά EVs, πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι τα παρασκευάσματα αυτά ενδεχομένως περιέχουν συστατικά μη EV (συσσωματώματα ριβονουκλεοπρωτεϊνών, λιποπρωτεΐνες, εξωμερή κ.λπ.).

° Η αναλογία αυτών των συναπομονωμένων συστατικών διαφέρει σημαντικά ανάλογα με τον τύπο του πρωτοκόλλου που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό των EVs, με ορισμένα (όπως η συγκέντρωση με βάση το πολυμερές) να εμφανίζουν ιδιαίτερα άφθονες προσμίξεις, καθώς και υπολείμματα του κατακρημνιστικού παράγοντα που μπορεί να επηρεάσουν τη λειτουργία των κυττάρων

  • Πρέπει να προσδιοριστεί αν μια λειτουργία είναι ειδική για τα εξωσώματα, σε σύγκριση με άλλα μικρά EVs

° Την τελευταία δεκαετία, πολλές μελέτες έχουν επικεντρωθεί αποκλειστικά στην απόδειξη της συσχέτισης μιας συγκεκριμένης λειτουργίας με τα εξωσώματα, ωστόσο υπάρχουν τεχνικοί περιορισμοί των μελετών αυτών και δεν αρκούν για να συμπεράνουμε, όπως γίνεται γενικά, ότι τα εξωσώματα έχουν ειδικές λειτουργίες σε σύγκριση με άλλα EVs

  • Τα μικρά κλάσματα που περιέχουν EV περιέχουν δυνητικά EV που προέρχονται από τα όψιμα ενδοσώματα (“εξωσώματα”) και άλλα που προέρχονται από την κυτταρική επιφάνεια (πλασματική μεμβράνη), με τις δύο κατηγορίες να μοιράζονται κοινούς μοριακούς παράγοντες
  • Τα εργαλεία που έχουν περιγραφεί μέχρι σήμερα για την παρεμπόδιση ή την ενίσχυση της έκκρισης των εξωσωμάτων δεν έχουν αξιολογηθεί επαρκώς ως προς την πιθανή επίδρασή τους στην έκκριση άλλων EVs.
  • Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι οι υποτιθέμενοι ρυθμιστές των εξωσωμάτων θα έχουν διαφορετικές συνέπειες σε διαφορετικά κύτταρα και υπό διαφορετικές συνθήκες και είναι σημαντικό να ποσοτικοποιείται προσεκτικά η τοξικότητα κάθε θεραπείας σε κάθε πειραματικό σύστημα, ώστε να αποκλείονται τεχνητές επιδράσεις στην ανάκτηση EV λόγω αυξημένου κυτταρικού θανάτου
  • Ορισμένοι διαμορφωτές της απελευθέρωσης EV επηρεάζουν άλλα σημαντικά ενδοκυτταρικά μονοπάτια που ενδέχεται να επηρεάζουν έμμεσα την έκκριση EV και να τροποποιούν τις κυτταρικές λειτουργίες εν γένει
  • Μια άλλη προειδοποίηση που πρέπει να ληφθεί υπόψη είναι ότι η διακοπή της έκκρισης ενός τύπου EV μπορεί να διαταράξει την παραγωγή άλλων τύπων EV, έτσι ώστε ο λειτουργικός τύπος EV να καλυφθεί από την υπερπαραγωγή ενός ανταγωνιστικού τύπου, οδηγώντας σε εσφαλμένο συμπέρασμα ότι ο τύπος EV που έχει διαταραχθεί είναι ο λειτουργικός EV.
  • Η απόδειξη ότι μόνο τα εξοσώματα που προέρχονται από τα όψιμα ενδοσώματα έχουν αναλυόμενη λειτουργία παραμένει πρόκληση.
  • Έως ότου επιτευχθεί σαφής προσδιορισμός συγκεκριμένων, μοναδικών μηχανισμών βιογένεσης που επηρεάζουν μόνο έναν συγκεκριμένο υποτύπο EVs, οι ερευνητές μένουν να προσπαθούν να απομονώσουν υποτύπους EVs μετά την έξοδό τους από το κύτταρο
  • Κατά την αναζήτηση του τρόπου απόδοσης συγκεκριμένων επιδράσεων που διαμεσολαβούνται από τα EVs σε συγκεκριμένα συστατικά των EVs, πολλές δημοσιεύσεις περιλαμβάνουν knock-out ή knock-down μιας συγκεκριμένης βιοδραστικής πρωτεΐνης ή RNA στο κύτταρο-δότη των EVs, μετά την οποία συγκρίνονται οι επιδράσεις των τροποποιημένων EVs στα κύτταρα-στόχους με τις επιδράσεις των μη τροποποιημένων EVs
  • Εάν η εγγενής επίδραση των EVs χαθεί, οι συγγραφείς συμπεραίνουν ότι η δραστηριότητα των EVs οφειλόταν στην ειδικά στοχευμένη πρωτεΐνη ή το RNA
  • Ωστόσο, ένα τέτοιο συμπέρασμα μπορεί να είναι ή να μην είναι έγκυρο ελλείψει εκτεταμένου χαρακτηρισμού των EVs που απελευθερώνονται από τα κύτταρα που έχουν εξαντληθεί για το στοχευμένο μόριο
  • Η αφαίρεση της πρωτεΐνης/του RNA που ενδιαφέρει μπορεί επίσης να οδηγήσει σε σημαντικές μεταβολές του εκκριτικού κυττάρου, με αποτέλεσμα πρόσθετες αλλαγές στην ποσότητα ή το μοριακό περιεχόμενο των EVs, γεγονός που θα μπορούσε επίσης να εξηγήσει τις αλλαγές στις επιδράσεις που προκαλούνται από τα EV στα κύτταρα-στόχους
  • Πρέπει να εξεταστεί κατά πόσον μια εξαρτώμενη από τα EV λειτουργία είναι ειδική για μια δεδομένη πηγή EV
  • Σε κάθε περίπτωση, πρέπει να είναι κανείς προσεκτικός όταν ισχυρίζεται μια συγκεκριμένη λειτουργία των EVs από μια συγκεκριμένη πηγή
  • Δεν θα είναι δυνατή η σύγκριση EVs από όλες τις διαφορετικές πηγές, επομένως το τελικό μήνυμα πρέπει να αντανακλά αυτή την αβεβαιότητα
  • Οι κατευθυντήριες γραμμές επιτρέπουν την εφαρμογή μιας “ρήτρας διαφυγής” εάν δεν μπορεί να επιτευχθεί αυστηρή τήρηση, πράγμα που σημαίνει ότι τα EVs δεν μπορούν να αποδειχθούν αυστηρά, απαιτώντας από τους συγγραφείς να αναφέρουν (και από τους κριτές να επιμένουν) τις επιφυλάξεις για εναλλακτικές ερμηνείες, δηλαδή ότι τα EVs μπορεί να συμβάλλουν, αλλά όχι απαραίτητα αποκλειστικά, σε ένα παρατηρούμενο φαινόμενο ή μοριακή υπογραφή

  • Από τις χιλιάδες εργασίες που δημοσιεύονται πλέον για τα EVs ετησίως, εύκολα αποκτά κανείς την εντύπωση ότι τα EVs παρέχουν βιοδείκτες για όλες τις ασθένειες και ότι τα EVs είναι φορείς όλων των σχετικών βιομορίων και είναι παντοδύναμα θεραπευτικά
  • Ταυτόχρονα, τα EVs είναι ετερογενή, ασύλληπτα και δύσκολα μελετήσιμα λόγω των φυσικών ιδιοτήτων τους και της πολύπλοκης σύνθεσης του περιβάλλοντός τους
  • Αυτή η επισκόπηση αφορούσε τις τρέχουσες προκλήσεις που αντιμετωπίζονται κατά την εργασία με τα EVs και πώς οι ερευνητές οραματίζονται ότι οι περισσότερες από αυτές τις προκλήσεις θα ξεπεραστούν στο εγγύς μέλλον
  • Αυτή τη στιγμή, αναπτύσσεται μια υποδομή (δηλαδή δεν υπάρχει επί του παρόντος) για τη βελτίωση της αναπαραγωγιμότητας των αποτελεσμάτων των μετρήσεων των EV
  • Συνολικά, οι εξελίξεις αυτές θα στηρίξουν την αξιοπιστία της έρευνας των EV με την εισαγωγή ισχυρής αναπαραγωγιμότητας, η οποία αποτελεί προϋπόθεση για την κατανόηση της βιολογικής τους σημασίας και του δυναμικού βιοδεικτών τους
  • Ο όρος “εξωκυτταρικά κυστίδια” εισήχθη από τη Διεθνή Εταιρεία Εξωκυτταρικών Κυστιδίων (ISEV) επειδή οι διάφοροι τύποι (συμπεριλαμβανομένων των εξωσωμάτων που προέρχονται από το ενδοσωμάτιο και των εκτοσωμάτων ή μικροκυψελίδων που προέρχονται από την πλασματική μεμβράνη των ζωντανών κυττάρων, καθώς και των αποπτωτικών σωμάτων των αποπτωτικών κυττάρων) των EV είναι συχνά δυσδιάκριτοι
  • Οι προκλήσεις στη μελέτη των EVs περιλαμβάνουν τις φυσικές ιδιότητες των EVs που διέπουν την ετερογένειά τους και τον τρόπο με τον οποίο η ετερογένεια αυτή επηρεάζει την απομόνωση και την ανίχνευση και την πολυπλοκότητα του αίματος για να καταδειχθούν οι δυσκολίες που αντιμετωπίζονται κατά τη μελέτη των EVs σε ένα σωματικό υγρό
  • Οι κατανομές μεγέθους των EVs έδειξαν ότι δεν υπάρχουν διακριτές κορυφές “μικρών EVs” και “μεγάλων EVs” (όπως υποτίθεται κάποτε για τα εξωσώματα και τα μικροκυψελίδια), αλλά ότι τα EVs μπορούν να έχουν σχεδόν οποιοδήποτε μέγεθος ή διάμετρο σε ένα συνεχές φάσμα
  • Με άλλα λόγια, με βάση το μέγεθος, δεν υπάρχουν διακριτοί πληθυσμοί μικρών και μεγάλων EVs
  • Έτσι, το μέγεθος των EVs που περιέχονται σε ένα παρασκεύασμα εξαρτάται από τη φυσική βάση της επιλεγμένης μεθόδου ή των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό ή τον εμπλουτισμό του δείγματος και διαφορετικές μέθοδοι θα παρέχουν διαφορετικά παρασκευάσματα EVs ξεκινώντας από το ίδιο υλικό.
  • Η πυκνότητα των EVs προκαλεί επίσης προκλήσεις, ιδίως κατά την απομόνωση των EVs
  • Στην περίπτωση του πλάσματος αίματος και του ορού, η πυκνότητα των EVs ελάχιστα διαφέρει από την πυκνότητα του περιβάλλοντός τους, και αυτή η χαμηλή “αντίθεση πυκνότητας” καθιστά δύσκολη την απομόνωση των EVs με φυγοκέντρηση
  • Είναι σημαντικό ότι υγρά όπως το πλάσμα αίματος και ο ορός περιέχουν επίσης σωματίδια μη EV, όπως σωματίδια λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας και αιμοπετάλια, η πυκνότητα των οποίων επικαλύπτεται με την πυκνότητα των EVs
  • Η γνώση της σύνθεσης των EVs έχει αποκτηθεί με τη χρήση τεχνικών που αναλύουν τη σύνθεση του όγκου πολλαπλών EVs, και επιπλέον, συχνά δεν έχει δοθεί επαρκής προσοχή στους κρίσιμους συγχυτικούς παράγοντες, καθώς δεν έχουν ακόμη αναγνωριστεί όλοι
  • Οι τρέχουσες τεχνικές επιτρέπουν ανεπαρκώς την ανάλυση των χρονοεξαρτώμενων μεταβολών στους πληθυσμούς των EV
  • Είναι σαφές ότι οι φυσικές ιδιότητες των EVs προκαλούν προκλήσεις για την (οπτική) ανίχνευση και απομόνωση
  • Με άλλα λόγια, μετά από 40 χρόνια, εξακολουθούν να μην είναι σε θέση να διακρίνουν με ακρίβεια τα EVs με την όραση (όπως στις εικόνες ΗΜ-Η΄λεκτρονικού Μικροσκοπίου)
  • Η τρέχουσα έλλειψη αναπαραγωγιμότητας στην έρευνα των εξωκυτταρικών κυστιδίων (EV) εμποδίζει την πρόοδο στην κατανόηση του βιολογικού τους ρόλου και της θεραπευτικής τους εφαρμογής
  • Η απομόνωση και οι αναλύσεις παρεμποδίζονται από:
  1. Η φυσική και βιοχημική ετερογένεια (διαφορετική ως προς το χαρακτήρα και το περιεχόμενο) των EVs
  2. την πολύπλοκη σύνθεση των ιστών και των βιορευστών που περιέχουν τα EVs
  3. Απροσδιόριστες μεταβλητές που επηρεάζουν την παρουσία και τη λειτουργία των EVs σε ένα βιολογικό δείγμα
  4. Η έλλειψη τόσο βαθμονόμησης των οργάνων όσο και τυποποιημένης αναφοράς των μεθόδων και των αποτελεσμάτων
  • Συχνά, τα EVs είναι παρόντα σε σύνθετα (σωματικά) υγρά με υψηλές συγκεντρώσεις κυττάρων, σωματιδίων μη EV και διαλυτών πρωτεϊνών
  • Επειδή τα αιμοπετάλια είναι μικρά κύτταρα (2-4 μm), στερούνται πυρήνα και έχουν πυκνότητα κοντά στα EVs, είναι δύσκολο να διαχωριστούν τα αιμοπετάλια από τα EVs με φυγοκέντρηση
  • Η παρουσία σωματιδίων εκτός EV, συμπεριλαμβανομένων των λιποπρωτεϊνών (πλάσμα), συσσωματωμάτων πρωτεϊνών και ακόμη και “ιών”, προκαλεί περισσότερα προβλήματα, καθώς μπορεί να επικαλύπτονται σε μέγεθος και πυκνότητα με τα EVs
  • Ομοίως, το μέσο κλιματιζόμενης καλλιέργειας συχνά περιέχει EVs, λιποπρωτεΐνες (συμπεριλαμβανομένων των χυλομικρών) και διαλυτές πρωτεΐνες από τον ορό που χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια των κυττάρων και το γάλα περιέχει όχι μόνο EVs αλλά και σωματίδια καζεΐνης, σφαιρίδια λίπους γάλακτος και ενδεχομένως λιποπρωτεΐνες που συν-απομονώνονται με EVs
  • Έτσι, η παρουσία σωματιδίων μη EV μπορεί να παρεμποδίσει τον διαχωρισμό και τον χαρακτηρισμό των EVs
  • Τα EVs καταρρέουν και εμφανίζονται συχνά ως δομές σε σχήμα κυπέλλου λόγω της σταθεροποίησης και της αφυδάτωσης κατά την προετοιμασία της εκλογικής μικροσκοπίας
  • Οι φυσικές ιδιότητες των EVs και η πολυπλοκότητα των υγρών που περιέχουν EVs αποτελούν προκλήσεις για την απομόνωση των EVs
  • Κατ’ αρχήν, οι διαθέσιμες σήμερα μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση των EVs διαχωρίζουν τα σωματίδια ουσιαστικά με βάση είτε:
    1. Μέγεθος
    2. Φορτίο
    3. Πυκνότητα
    4. Βιοχημική σύνθεση
  • Ως γενικός κανόνας, μπορεί κανείς να δηλώσει ότι όταν τα EVs απομονώνονται με μία μέθοδο, δηλαδή με μία μέθοδο που απομονώνει τα EVs με βάση το μέγεθος, το φορτίο, την πυκνότητα ή τη βιοχημική σύνθεση, τα απομονωμένα EVs είναι πιθανό να είναι ακάθαρτα και να περιέχουν συγχυτικούς παράγοντες
  • Υπάρχουν πολλές γνωστές και πιθανώς ακόμη περισσότερες άγνωστες μεταβλητές που μπορεί να επηρεάσουν τα αποτελέσματα της μέτρησης των EV
  • Δεν γνωρίζουν όλες τις μεταβλητές και διαθέτουν περιορισμένα εργαλεία για να αξιολογήσουν και να ποσοτικοποιήσουν τις επιδράσεις αυτών των μεταβλητών με αναπαραγώγιμο τρόπο
  • Αν και τα βιολογικά συστήματα είναι δύσκολο, αν όχι αδύνατο, να τυποποιηθούν, οι αρχές της μετρολογίας διερευνώνται τώρα στον τομέα των EV για να ανοίξουν το δρόμο προς την αναπαραγωγιμότητα (δηλαδή δεν υπάρχει αναπαραγωγιμότητα επί του παρόντος)
  • Ο τομέας κινείται ενεργά προς την κατεύθυνση ιχνηλάσιμων και αναπαραγώγιμων μετρήσεων μέσω μιας κοινοτικής υποδομής (δηλ. δεν υπάρχουν σήμερα αναπαραγώγιμες μετρήσεις).
  • Η βαθμονόμηση των οργάνων αναμένεται να ανοίξει το δρόμο προς τα εξής:

° Παρακολούθηση πιθανών διακυμάνσεων που προκαλούνται από το βιοδείγμα και τις προ-αναλυτικές διαδικασίες.

° Ελέγχου της αποτελεσματικότητας (της ικανότητας παραγωγής ενός επιθυμητού ή επιδιωκόμενου αποτελέσματος) των διαδικασιών απομόνωσης.

° Εκτέλεση πολυκεντρικών μελετών

° Καθορισμός περιοχών αναφοράς των ειδικών για κυτταρικό τύπο EVs σε σωματικά υγρά για κλινική χρήση.

  • Η αναπτυχθείσα υποδομή μπορεί να τοποθετήσει την έρευνα για τα EV σε θέση πόλου στον τομέα της (βιο)ιατρικής έρευνας, παράγοντας αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα δεδομένα, τα οποία με τη σειρά τους μπορούν να συμβάλουν στην υπέρβαση των προβλημάτων αναπαραγωγιμότητας στην επιστήμη (δηλαδή, για άλλη μια φορά, δεν υπάρχει σήμερα αναπαραγωγιμότητα καθώς προσπαθούν να εργαστούν προς αυτή την κατεύθυνση)

Θα πρέπει να είναι προφανές ότι για να εμπιστευτούμε την εγκυρότητα οποιουδήποτε επιστημονικού ισχυρισμού, ειδικά όσον αφορά αόρατες οντότητες, πρέπει να επαληθεύσουμε τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη τους. Η τεχνολογία που χρησιμοποιείται πρέπει να αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική για το έργο που της έχει ανατεθεί. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν πρέπει να μπορούν να αναπαραχθούν και να επαναληφθούν ανεξάρτητα. Οι πρακτικές μεταξύ των εργαστηρίων και των ερευνητών πρέπει να τυποποιηθούν, ώστε να διασφαλιστεί ότι τα ζητήματα αυτά αντιμετωπίζονται από την αρχή. Ωστόσο, αυτό συμβαίνει σπάνια, αν συμβαίνει ποτέ.

Χρησιμοποιώντας το παράδειγμα της έρευνας των εξωσωμάτων, μπορούμε να δούμε ότι για τη συντριπτική πλειονότητα των 40 και πλέον ετών της ταχέως αναπτυσσόμενης έρευνας, δεν υπήρχαν τέτοιοι έλεγχοι ποιότητας. Οι ερευνητές αφέθηκαν στην τύχη τους προκειμένου να παράγουν όποια πειραματικά δεδομένα εξυπηρετούσαν τις ανάγκες και τους σκοπούς τους. Τα δεδομένα αυτά συλλέγονταν αλλά δεν επικυρώνονταν ποτέ. Μια οντότητα “ανακαλύφθηκε” αλλά οι μέθοδοι που απαιτούνται για τον πλήρη διαχωρισμό των υποτιθέμενων σωματιδίων του εξωσώματος από οτιδήποτε άλλο δεν υπάρχουν. Λόγω αυτής της αδυναμίας διαχωρισμού των εξωσωμάτων από τους “ιούς” και άλλα εξωκυτταρικά κυστίδια του ίδιου μεγέθους, σχήματος και πυκνότητας, ο χαρακτηρισμός και η λειτουργία αυτών των οντοτήτων παραμένει μη επαληθεύσιμη. Οι “ειδικές” πρωτεΐνες και οι μοριακοί δείκτες που ισχυρίζονται ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να διαφοροποιήσουν αυτά τα σωματίδια μεταξύ τους δεν έχουν ποτέ επικυρωθεί ούτε έχει αποδειχθεί ότι προέρχονται από την οντότητα που υποτίθεται ότι υπάρχει μέσα στο δείγμα. Καθώς μοιάζουν ίδια με τα υπόλοιπα σωματίδια που δεν ανήκουν στα ΕΒ και τα “ιικά” σωματίδια, τα εξωσώματα δεν μπορούν να διακριθούν με βάση οπτικά μέσα μέσω της απεικόνισης με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Ακριβώς όπως και τα αντίστοιχα “ιογενή” σωματίδια, οι οντότητες που είναι γνωστές ως εξωσώματα δεν μπορούν να απομονωθούν, να χαρακτηριστούν ούτε να διαφοροποιηθούν από τα άλλα συστατικά εντός του δείγματος.

Γνωρίζοντας αυτό, πώς μπορεί να ληφθεί σοβαρά υπόψη οποιαδήποτε από τις εργασίες που ισχυρίζονται ότι παρουσιάζουν αυτές τις οντότητες και περιγράφουν τις βιολογικές τους λειτουργίες; Πώς μπορεί να εμπιστευτεί κανείς οποιαδήποτε πληροφορία; Το γεγονός ότι η έρευνα των εξωσωμάτων αμαυρώνεται από μια κρίση αναπαραγωγιμότητας θα πρέπει να σας λέει όλα όσα πρέπει να γνωρίζετε για την εγκυρότητα της έρευνας των εξωσωμάτων. Η αναπαραγωγιμότητα είναι ομολογουμένως απαραίτητη προϋπόθεση για την κατανόηση της βιολογικής τους σημασίας και του δυναμικού τους ως βιοδείκτες. Ωστόσο, προκειμένου να επιτευχθεί αυτή η απαιτούμενη αναπαραγωγιμότητα, πρέπει να περιμένουμε τη μελλοντική τεχνολογία και την εφαρμογή τυποποιημένων μεθόδων. Καθώς κάτι τέτοιο δεν υπάρχει, μας μένει ένας μεγάλος σωρός δημιουργικής γραφής με το πρόσχημα της έρευνας των εξωσωμάτων που έχει συσσωρευτεί τις τελευταίες τέσσερις δεκαετίες. Αν βαρεθείτε, αναζητήστε την έρευνα για τα εξώσωμα δίπλα στα έγγραφα ιολογίας στο τμήμα επιστημονικής φαντασίας της τοπικής σας βιβλιοθήκης.


***********

Δικτυογραφία:

Exosomes: Fact or Fiction?

https://viroliegy.com/2022/07/07/exosomes-fact-or-fiction/

 

Πηγή και μετάφραση, ΑΠΟΛΛΟΔΩΡΟΣ

Προβολές : 888


Μοίρασέ το:



Ετικέτες: , , ,

Αγαπητοί αναγνώστες των ΑΤΤΙΚΩΝ ΝΕΩΝ,

Δώδεκα χρόνια, συνταξειδεύουμε μαζί στον χώρο της διαδικτυακής ενημέρωσης. Σ’ αυτά τα χρόνια, στάθηκα δίπλα σας , με μοναδικό στόχο την ενημέρωσή σας, όσο πιο αντικειμενικά μπορούσα αφιερώνοντας ατέλειωτες ώρες γι'αυτήν. Μετά την διαγραφή του πρώτου μου ιστολογίου, αναγκάστηκα να πάω σε άλλη πλατφόρμα και να πληρώνω ένα σημαντικό ποσόν κάθε μήνα, για την ασφάλεια του ιστολογίου μου.

Μπορείτε να στηρίξετε αυτή την προσπάθεια, με την μηνιαία συνδρομή σας, στην Paypal επιλέγοντας το μπανεράκι που βρίσκεται ακριβώς κατώ απο το κείμενο αυτό , και να προχωρήσετε στην διαδικασία δωρεάς όσο κοστίζει ένας καφές.

Η διαδικασία είναι πολύ απλή είτε έχετε λογαριασμό Paypal είτε όχι.Το μόνο που έχετε να κάνετε είναι να συμπληρώσετε το ποσο και να επιλέξετε το κουτάκι με την σήμανση 'Make this a monthly donation' και εν συνεχεία να πατήσετε το κουμπακι 'Donate with PayPal' αν έχετε λογαριασμό με Paypal , η 'Donate with a Debit or Credit Card', αν δεν έχετε λογαριασμό με Paypal και κάνετε την δωρεά με χρεωστική η πιστωτική κάρτα.

Αν έχετε πρόβλημα με την διαδικασία μπορείτε να επικοινωνήσετε στο email [email protected] η να στείλετε μήνυμα απο την φόρμα επικοινωνίας που βρίσκεται σταθερά στο κάτω μέρος της σελίδας.

Σας ευχαριστώ για την στήριξη σας.

Καλλιόπη Σουφλή


ΕΠΙΣΗΜΑΝΣΗ


Ορισμένα αναρτώμενα από το διαδίκτυο κείμενα ή εικόνες, θεωρούμε ότι είναι δημόσια. Αν υπάρχουν δικαιώματα συγγραφέων, παρακαλούμε ενημερώστε μας, για να τα αφαιρέσουμε. Επίσης, σημειώνεται ότι οι απόψεις του ιστολογίου, μπορεί να μην συμπίπτουν με τα περιεχόμενα του άρθρου. Για τα άρθρα που δημοσιεύονται εδώ, ουδεμία ευθύνη εκ του νόμου φέρουμε, καθώς απηχούν αποκλειστικά τις απόψεις των συντακτών τους και δεν δεσμεύουν καθ’ οιοδνήποτε τρόπο, το ιστολόγιο. Ο διαχειριστής του ιστολογίου, δεν ευθύνεται για τα σχόλια και τους δεσμούς που περιλαμβάνει. Τονίζουμε ότι υφίσταται μετριασμός των σχολίων και παρακαλούμε, πριν δημοσιεύσετε το σχόλιό σας, να έχετε υπόψη σας τα ακόλουθα:
  • Κάθε γνώμη είναι σεβαστή, αρκεί να αποφεύγονται ύβρεις, ειρωνείες, ασυνάρτητος λόγος και προσβλητικοί χαρακτηρισμοί, πολύ περισσότερο σε προσωπικό επίπεδο, εναντίον των συνομιλητών ή και των συγγραφέων, με υποτιμητικές προσφωνήσεις, ύβρεις, υπονοούμενα, απειλές ή χυδαιολογίες.>
  • Μην δημοσιεύετε άσχετα με το θέμα σχόλια.
  • Ο κάθε σχολιαστής, οφείλει να διατηρεί ένα μόνον όνομα ή ψευδώνυμο, το οποίο αποτελεί και την ταυτότητά του σε κάθε συζήτηση.
  • Με βάση τα παραπάνω, η διαχείριση, διατηρεί το δικαίωμα μη δημοσίευσης σχολίων, χωρίς καμία άλλη προειδοποίηση.
  • Επιπλέον σας τονίζουμε, ότι το ιστολόγιο, λειτουργεί σε εθελοντική βάση και ως εκ τούτου, τα σχόλια θα αναρτώνται μόλις αυτό καταστεί δυνατόν.

Διαβάστε ακόμα